分类: 医学研究, 时空组学, 智能制造
2024年9月,中山大学附属第五医院戴英波教授、汤育新教授、赵亮宇博士等人在学术期刊Cell Reports发表首个人类、大鼠海绵体空间图谱,题为:Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution。在该文章中,研究者利用百创S1000空间转录组技术首次搭建了生理病理条件下,人类和大鼠阴茎海绵体空间图谱。联合scRNA-seq等技术,研究者阐述了人类与大鼠海绵体微环境异同,加强了高空间分辨度和单细胞水平下对哺乳动物阴茎海绵体微环境的认识,为后续研究勃起调控、阴茎海绵体相关疾病中,细胞异质性和胞外机械力异质性提供参考。

文章标题:Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution

期刊名称:Cell Reports
影响因子:7.5
合作单位:中山大学附属第五医院研究方法:Masson/天狼星红/H&E/油红O/尼罗红/菲律宾链霉菌染色、scRNA-seq、空间转录组技术、bulk RNA-seq、免疫荧光、超声弹性成像、细胞实验

百迈客生物为该研究提供了百创S1000空间转录组技术服务。

研究背景

阴茎勃起是一个复杂的生物学过程,整个过程需要神经、内分泌、血管和阴茎海绵体组织精密调节、协调完成。海绵体损伤可引起多种疾病,包括影响了5%~22%男性的阴茎勃起功能障碍(ED)。

ED不仅影响患者身心健康以及家庭和谐,还可能是心血管疾病的先兆。虽然目前已经知道在勃起发生和维持中不同功能区域的作用,但以往研究大多都依赖于解剖观察、影像学检查,以及少数基因或蛋白质的表达模式分析,缺乏全面的分子水平分析。

此外,多数ED相关研究是基于大鼠模型的,但当前对于大鼠和人类间阴茎海绵体(CC)的解剖学和信号网络差异认识尚不清晰。因此,为了更好的使用大鼠模型开展研究,有必要深入研究大鼠阴茎海绵体的结构/功能调控与人类的异同。

材料方法

研究材料:4例阴茎癌患者,3例健康志愿者,10例DMED(糖尿病性勃起功能障碍)患者;4只健康大鼠,6只DMED大鼠模型。

研究方法:Masson/H&E染色(n=7),scRNA-seq(n=12,3例健康人类CC/3例DMED人类CC,3例健康大鼠CC/3例DMED大鼠CC),空间转录组技术(BMKS1000,n=3,1例阴茎肿瘤患者、1例勃起功能正常雄性大鼠以及1例DMED模型大鼠)等。

验证实验:包括油红O/尼罗红/菲律宾链霉菌染色、不同硬度ECM条件下培养的FB细胞形态信息及bulk RNA-seq数据、免疫荧光、超声弹性成像。

研究结果

1.人类和大鼠CC细胞和空间特征

通过scRNA-seq数据,研究者在人类CC(阴茎海绵体)中鉴定出7种类型细胞,仅在大鼠CC中发现一小部分中性粒细胞和B细胞。使用scRNA-seq数据对空间转录组数据进行注释(CellTrek),研究者得到了人类和大鼠CC样本空间细胞分布图谱(level3,20μm分辨度),发现虽然人类和大鼠CC中的细胞类型相似,但每种类型细胞比例、空间分布特征存在异质性。

图1-通过scRNA-seq和空间转录组技术得到的人类,以及正常/DMED条件下大鼠的CC细胞全局表达谱

2.人类和大鼠CC组织中的空间异质性

作为一种特殊的血管窦结构,当前已初步认识到CC上不同区域的类型不同。得益于空间转录组技术,研究者发现人类CC组织中SVG(空间差异基因)top(如CCL18、PLA2G2A、C3)主要在不同类型细胞中表达,但有一些表现出空间分布特异性的基因并没有在scRNA-seq数据中表现出细胞类型特异性;人类CC组织3个代表性区域中,不同区域的细胞比例不同,如区域I(海绵体动脉区域)EC(内皮细胞)占比更高,而区域III(白膜附近区域)包含更少的FB(成纤维细胞)但SMC(平滑肌细胞)丰富。大鼠CC组织也表现出相似的情况(大鼠CC中缺乏梳状中隔和明显的海绵体动脉,研究者根据人类CC代表性区域的空间位置,在大鼠CC中也划分出可比较的3个代表性区域)。

图2-人类CC组织的转录特征和空间异质性

3.根据scRNA-seq数据比较人类和大鼠CC中的细胞类型

多数勃起调控研究是基于大鼠模型的。为了理解大鼠和人类间CC微环境的异同,研究者通过分析scRNA-seq数据中的人—大鼠同源基因,发现虽然人类和大鼠物种不同,但CC中相同类型细胞仍可以聚成同一簇,进一步分析发现人类和大鼠CC中相同类型细胞的转录相似性>70%且正相关,表明在多数情况下,使用大鼠模型模拟、研究人类CC微环境的转录调控是可接受的。然而,人类和大鼠CC中相同类型细胞的DEGs(差异表达基因)top并不一致,提示当研究者更关注一个或几个基因或通路时,使用大鼠模型要特别注意。

附录图7-scRNA-seq数据评估得到的大鼠和人类CC间相似性和差异性

4.比较人类和大鼠CC空间转录组全局

通过分析空间转录组数据中的人—鼠同源基因,研究者找到人类和大鼠共有的459个top SVG,大多数SVG并不是细胞类型特异的,其中EC、FB和SMC是表达这些SVG最多的3种类型细胞。富集分析结果显示,基础生物学过程如“translational initiation”、“extracellular structure organization”以及“protein targeting”,在人类和大鼠CC组织的空间转录组数据中是保守的;人类特异SVG主要与炎症响应有关,而这些SVG的大鼠同源基因主要与代谢过程有关。

图3-比较大鼠和人类CC微环境中的空间差异基因和信号通路

5.人类和大鼠CC微环境中的细胞—细胞互作分析

为了研究、比较人类和大鼠间CC微环境的复杂信号网络,研究者使用scRNA-seq数据进行CellChat分析,发现大鼠CC中的细胞互作数量虽然小于人类,但细胞互作强度是相似的。基于这些互作的表达模式,研究者进行简单的分类,发现虽然胞外基质相关的互作整体强度与细胞类型间配体-受体强度相当,但两者基因组成是有差异的;血管生成相关的互作整体强度在人类和大鼠中没有差异,但基因组成存在差异,如大鼠CC微环境中是主要是VEGFB表达,而人类CC微环境中高表达的是VEGFA和IGF1。

空间转录组数据显示,VEGF配体主要集中富集在人类CC中的海绵体动脉(区域I)附近,而在蛋白质水平,VEGFA和IGF1并不共定位。大鼠中VEGF和IGF基因的空间分布模式与人类的相似,但蛋白质水平上区域I中存在高浓度的VEGFA和IGF1。此外,免疫相关的互作在人类CC与大鼠CC中表现出相似或者更高的整体信息流,但一些配体亚型在大鼠中高表达。

这些scRNA-seq数据的分析结果与基于空间转录组数据SVG的富集分析结果高度一致。

图4-配体-受体对分析显示人类和大鼠CC组织中的细胞—细胞通讯

6.EC表现出显著的空间异质性和物种差异

根据以往的解剖观察以及scRNA-seq数据分析,可知CC中包含3种类型EC(内皮细胞),包括GJA5+ EC(动脉内皮细胞)、SELP+ EC(静脉内皮细胞)以及KIT+ EC(海绵体窦内皮细胞)。人类CC中GJA5+ EC占比最低,主要分布在海绵体动脉区域;SELP+ EC主要分布在白膜区域;KIT+ EC广泛分布。但大鼠CC中,Selp+ EC比例更高,Gja5和Kit可能并不是有用的静脉和CC内皮细胞标志物。基于scRNA-seq数据进行GO分析,研究者发现不同类型EC富集了不同功能,多数细胞类型特异性的term(条目)在人类CC中并没有空间分布异质性,但一些特殊term在大鼠CC中表现出空间分布异质性。

附录图10-人类和大鼠EC簇间的物种相似性和异质性

7.SMC表现出显著的空间异质性和物种差异

根据以往研究结果,研究者将CC中的SMC(平滑肌细胞)簇分为VSMC(血管平滑肌细胞)和CCSMC(海绵体小梁平滑肌细胞)。数据分析结果显示,两种类型SMC在物种间存在显著差异,其中人类CCSMC高表达DES,VSMC高表达RGS5;大鼠CCMS和VSMC可通过Igfbp2和Rgs5区分;蛋白质水平上,CCSMC与VSMC不同,后者不表达肌动蛋白或肌球蛋白;根据SMC的SVG空间分布模式,发现ACTC1/Actc1只在人类CCSMC中表达;前期研究发现ADRA2A在人VSMC表达,ADRA2C在人CCSMC中表达,空间转录组数据也验证了这一发现,但大鼠CC中Adra2a并没有表现出细胞类型特异性而Adra2c的表达未检测到,提示在这个方面大鼠并不是合适的研究模型。

图5-人类和大鼠SMC簇间的物种相似性和异质性

8.人类和大鼠FB有相似的聚类特征和空间分布,但亚型比例不同

近期,CC的FB(成纤维细胞)成为研究热点,但对其空间和物种异质性仍不清楚。研究者根据PI16、APOE及其他载脂蛋白、COMP的表达情况,将人类CC FB分成3种亚群。空间转录组数据分析结果显示,人类CC中3种FB亚群空间分布模式不同,富集的功能也不同;大鼠CC FB表现出与人类CC FB相似的亚群和标志基因,但每种亚群的比例与人类显著不同。

APOE与脂滴转运密切相关。油红O染色显示大鼠CC中脂滴位置与Apo+ FB的空间分布高度一致,且都在白膜下富集;免疫荧光染色结果显示大多数脂滴与APOE蛋白共区域化出现且在白膜下有更高的富集,特别是在区域III(左右CC连接区域);人类CC中APOE分布特征与大鼠类似但表达更广泛。

前期研究成果显示,FB是人类CC中最强的外向信号源,在调控微环境稳态中起到重要作用。因而,FB表型转变可能与CC结构和功能变化密切相关。通路活性分析显示PI3K通路活性分值与APO+ FB有相似的空间分布模式,而TNF-α和TGF-β的空间分布模式与之相反;空间上CCSMC与FB相距较远(level13,100μm分辨度分析FB生态位),而GJA5+ EC、VSMC、SWC(Schwann细胞)和T细胞与COMP+ FB空间距离较近,表明COMP+ FB与神经和血管密切相关;CXCLs、CCN2以及C3与3种FB亚群生态位正相关,但CCN5和C7与COMP+ FB生态位负相关,GREM1不与PI16+ FB或APO+ FB相关但与COMP+ FB生态位显著正相关。

图6-CC中不同成纤维细胞亚群表现出不同的空间分布特征

9.CC中机械力信号存在空间异质性,并调控FB表型转变

以往研究表明病理条件下YAP信号诱导FB-肌成纤维细胞表型转变,但这不能完全解释生理条件下存在着的多种FB亚型,特别是有高脂质代谢活性的APO+ FB。有报道ECM(胞外基质)机械力调控多种细胞类型的脂质代谢。

本研究中,研究者发现COMP+ FB生态位显著富集了“integrin-mediated signaling pathway”和“response to mechanical stimulus”term;人和大鼠CC中ECM/细胞组成比例表现出明显的空间异质性;空间转录组数据和免疫荧光染色结果类似,靠近阴茎背神经血管束的上极区域显示出较低的纤维化水平,而远离背神经血管束的显示出较高的纤维化水平;空间转录组数据和超声弹性成像结果都表明,APO+ FB与更柔软的组织硬度有关,而COMP+ FB与更硬的组织有关;不同胞外基质硬度培养下的CC FB形态不同,bulk RNA-seq数据显示机械应激显著改变了FB的转录状态,一些参与调控脂质代谢的基因与低机械力信号有关;scRNA-seq数据分析结果显示APO+ FB分值随组织硬度增加而降低,COMP+ FB分值随组织硬度增加而增加;染色结果显示随着组织硬度增加,FB中的中性脂质和胆固醇累积降低。

综上,这些结果表明机械力信号直接参与调控FB的表型转变。

图7-局部机械力信号强度决定了这个区域内成纤维细胞的表型

10.人类和大鼠CC经历了相似的DMED病理变化

为了更好的认识DMED病理条件下,人类和大鼠CC微环境发生的变化是否与每种CC细胞类型中发生的分子水平变化相一致,研究者通过分析scRNA-seq数据,发现DMED大鼠模型和DMED患者都经历了显著的纤维化以及细胞组分丢失,但两者间的转录组差异显著。富集分析结果显示,仅DMED大鼠模型富集了“extracellular structure organization”;“actin cytoskeleton or organization”和“oxidative phosphorylation”仅在人类DMED患者SMC中发现,“regulation of MARK cascade”仅在DMED大鼠模型SMC中富集;“rhythmic process”仅在人类DMED患者FB中富集,“leukocyte activation”仅在DMED大鼠模型FB中富集。

空间转录组数据显示DMED大鼠模型阴茎中,除尿道以外的组织区域转录表达水平整体降低,而scRNA-seq数据显示DMED状态细胞的转录水平高于正常状态的细胞,这或许意味着,可能是由于单位面积上细胞数量降低,导致空间转录组数据出现转录水平降低的现象。

附录图13-通过scRNA-seq和空间转录组评估DMED条件下CC的病理变化

研究总结

本文绘制了人类和大鼠阴茎海绵体(CC)的生理、病理条件下的空间转录组图谱,结合多组学数据,系统比较了两个物种间的异同。本研究成果为人类、大鼠阴茎海绵体的分子解剖学,以及跨细胞类型和区域的信号网络提供了清晰洞见。同时在分子水平比较了人类和大鼠的阴茎海绵体异同,为理解动物模型的可用性提供基础数据,推动临床前实验和临床转化更高效、可靠。文中还阐述了CC中机械力信号的空间分布异质性,并确认ECM机械信号可以调节FB表型转变,提出靶向APO+ FB或可成为未来治疗DMED的有效手段。最后,研究者也明确指出了本文中研究的局限性,为后续研究指明了方向。

参考文献:

Yin et al, Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution. Cell Rep. 2024 Sep 24;43(9):114760. doi: 10.1016/j.celrep.2024.114760. Epub 2024 Sep 18.

 

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