宏转录组测序

从转录水平研究复杂微生物群落变化

宏转录组测序服务简介

宏转录组 (Metatranscriptomics)主要从群体水平上研究环境样品中微生物的全部转录本（即mRNA） 的表达水平及其在不同环境条件下的转录调控规律，并研究微生物与自然环境的相互关系。宏转录组能从转录水平研究复杂微生物群落变化，能更好的挖掘潜在的新基因。

通过对这些转录本进行大规模高通量测序，可以直接获得环境中可培养和不可培养的微生物转录组信息。这种技术不仅具有宏基因组技术的全部优点，可以检测环境中的活性微生物、活性转录本以及活性功能进行研究，还可以比较不同环境下的差异表达基因和差异功能途径，揭示微生物在不同环境压力下的适应机制，探索环境与微生物之间的互作机理。

宏转录组实验流程

  • 1、环境样品RNA抽提

  • 2、rRNA去除

  • 3、构建转录组文库

  • 4、桥式PCR

  • 5、Illumina平台测序

宏转录组学分析流程

宏转录组测序分析流程

分析结果展示

基因数目韦恩图
基因数目韦恩图不同颜色代表不同样品/组，圈和圈重叠部分的数字代表对应样品/组之间共有的 Unigene个数，没有重叠部分的数字代表样本/组特有的Unigene个数。
Krona 分析
Krona分析圆圈从内到外依次代表不同的分类级别（界门纲目科属种）；扇形的大小代表不同物种的相对比例。
代谢通路注释图
代谢通路注释图方框为基因或蛋白；箭头指向的节点为化学分子（即底物或产物）；圆角长方形为与本通路相关联的其他通路，图中高亮边框表示能被本次测序的基因所注释到。箭头说明：酶反应方向或信息传递方向等；实线表示直接作用，虚线表示间接作用。
物种-功能-丰度柱状图
物种-功能-丰度柱状图基于 NR 库的物种注释及 KEGG 、eggNOG 及 CAZy 功能注释结果下，分别在不同分类学水平上统计物种/功能在各样品中的相对丰度。选取各分类水平相对丰度排名前 10 名，绘制出各样品的物种/功能丰度柱形图。
样品间相关系数热图
样品间相关系数热图横纵坐标分别为各样本，图中颜色对应两样本间的相关系数值。
物种-功能-Bubble图
物种-功能-Bubble 图Bubble图利用气泡的大小，直观反映物种-功能-丰度二维矩阵中的数据信息。默认对物种的phylum和species 水平、KEGG 、eggNOG 及 CAZy 各分类结果的丰度分布，以帮助寻找优势及差异的物种、KEGG、NOG 及 CAZy 功能等信息，以及分析其变化趋势。

送样要求

样本 浓度 总量 备注
RNA样品 ≥50ng/μL ≥1μg  

1.无基因组污染、无蛋白和杂质污染、无颜色异常

2.滤膜直径3-4cm/孔径0.22或0.45μm

3.所有的核酸样品，需要保存在1.5ml或2ml的EP管中
土壤、淤泥、沉积物 — ≥5g
粪便 — ≥2g
水体样为滤膜 — ≥2张

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常见问题

1、RNA质检不合格怎么办?

1、条带完整性（RIN值）反应RNA降解程度，RIN值偏低时（RIN＜3），可能会导致部分物种片段丢失，对序列拼 接等生信分析产生一定影响；

2、DNA污染，会严重影响文库构建，建库时默认进行DNA消化；

3、总量偏少（1ug<总量＜0.5 μg属于B类风险实验），仅满足单次建库用量，若建库结果未达标则无法重新实验；

4、总量不足（总量＜1 μg属于C类），不满足单次建库用量，可尝试风险建库，文库构建失败概率较高，或文库产 量低无法满足上机测序要求，可能影响随机性，若建库结果未达标则无法重新实验，建议重新送样

5、样本收集过程导致RNA降解，建议重新送样（样本收集及处理时间过长；采样后未能迅速液氮速冻；提取器械、 耗材等未进行去除RNA酶处理；未戴上手套和口罩等）

2、宏基因组学与宏转录组学的区别

宏基因组测序是将环境总DNA提取出来，随机打断成300/500bp的小片段，然后在片段两端加入通用引物进行PCR扩增测序，然后对测序数据进行质控，再将高质量序列拼接，根据数据库参考信息，对基因序列进行预测和功能注释，最终获得重要的宏基因组信息，如序列组成（GC含量、基因组大小等）、物种组成、功能组成和群落特征等。

宏转录组测序是指从整体水平上研究某一特定环境、特定时期群体生命全部基因组转录情况以及转录调控规律的研究手段。它以生态环境中的全部RNA为研究对象，提取环境微生物群落中的全部转录本，进行高通量测序和生物信息学分析，与宏基因组研究相辅相成，能够很好地揭示复杂微生物群落的变化，有效地扩展微生物资源的利用空间。

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