Small RNA测序

产品介绍

small RNA测序是生命活动重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina能够对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究。

miRNA鉴定

miRNA转录起始位点多位于基因间隔区、内含子以及编码序列的反向互补序列上,其前体具有标志性的发夹结构,成熟体的形成是由Dicer/DCL酶的剪切实现的。对于已知miRNA的鉴定,我们将比对上参考基因组的reads序列与已知miRNA数据库miRBase(v21)中的成熟miRNA序列进行比对。针对miRNA的生物特征,对于未鉴定到已知miRNA的序列,百迈客利用miRDeep2软件进行新miRNA的预测。

mirna-2
mirna-3

基因表达水平分析

利用转录组数据检测基因表达具有较高的灵敏度。通过FPKM密度图和箱线图不仅可以反映单个样品基因表达水平分布和离散程度,还可以直观的比较不同样品的整体基因表达水平差异。

差异表达miRNA聚类分析

聚类分析用于判断差异基因在不同实验条件下的表达模式,可通过将表达模式相同或相近的基因聚集成类,从而识别未知基因的功能或已知基因的未知功能,同类基因可能具有相似的功能或共同参与同一代谢过程。对筛选出的差异表达miRNA做层次聚类分析,将具有相同或相似表达行为的miRNA进行聚类。

mirna-4
mirna-5

差异miRNA靶基因注释

生物体内,在特定条件下某些基因对应的转录本会形成miRNA前体,失去编码功能,从而影响生物学表型。因此,针对miRNA的靶基因分别进行GO和KEGG注释及富集分析,有助于深入挖掘小RNA功能。

Q1. 动植物在miRNA预测中有什么差别:

答:植物miRNA可与mRNA的编码区完全互补配对,并通过诱导mRNA降解而发挥抑制表达的作用,我们可以直接通过比对来筛选靶基因
动物miRNA则可与mRNA的3’UTR区部分互补配对结合,进而抑制翻译的进行,一般的,miRNA与mRNA的配对区域位于miRNA的5’端的 2-8个碱基,称为种子区,只要种子区能与mRNA互补配对即可发挥作用,这也是一个miNRA能够调控数百条mRNA的原因。
①对于动物预测靶基因我们不是直接通过比对进行筛选的。
②在动物预测时,由于我们没法给出3‘utr区,因此我们截取mRNA5’端前2000bp使用动物预测靶基因方法进行预测,target_length指的就是我们截取该基因的长度。

Q2. 分析结果中如何确定miRNA对应的pre-miRNA的数量(别人论文中有这样的结论:We identified 83 potential novel miRNAs, which corresponded to 95 genomic loci.)?

答:文献中的描述是指某些成熟的miRNA序列可能来自于不同的miRNA前体序列,无参项目中分析的novel miRNA是针对每个Unigene分析的,命名也是与Unigene对应,没有对成熟miRNA的序列进行重复的分析。对成熟的miRNA的序列进行去重复统计,例如某项目预测出了229个miRNA,其中有6个miRNA分别来自于两个不同的前体序列,故可表述为:预测出了223个miRNA,对应了229个前体序列。

Q3. 目前对于小RNA靶基因的结果验证方法有哪些?

答:

  1. RT-PCR对miRNA进行定量验证;
  2. miRNA过表达;
  3. 荧光素酶法,过表达miRNA测定靶基因表达量;把靶基因连上一个荧光素酶,如果靶基因表达量下降,可检测到的荧光信号则减弱
  4. 降解组测序