原核链特异性转录组

基因表达精准研究

原核链特异性转录组服务介绍

原核转录组指的是在特定时间、特定环境条件下，一个原核生物（如细菌、古菌）细胞内所有转录本（RNA）的集合，传统的Northern Blot、RT-qPCR等方法只能研究个别基因。如今，高通量测序技术是研究转录组的绝对主流。

原核转录组学是打开原核生物生命活动“黑箱”的一把关键钥匙。它使我们能够从全局视角，动态地理解细菌如何生存、适应、致病和发挥作用。随着测序技术的不断进步和生物信息学分析方法的日益强大，原核转录组学将继续在基础研究、医学、工业和环境科学等领域发挥不可替代的作用。

原核转录组的独特特征

与原核生物的特殊细胞结构（无核膜）和基因结构密切相关，其转录组具有一些鲜明特点：

基因排列紧凑：基因组中编码区占比高，基因间隔区短，非编码RNA和调控序列需要更精细的分析来识别。

缺乏内含子：基因中没有内含子，因此转录后没有RNA剪接过程，转录本结构相对简单。

转录与翻译偶联：由于没有核膜的物理分隔，mRNA在转录的同时就可以被核糖体结合开始翻译，这使得mRNA的寿命通常很短（几分钟），转录组状态变化非常迅速。

广泛的调控RNA：存在大量sRNA，它们通过与靶标mRNA碱基配对来调控其稳定性或翻译效率，是转录后调控的核心。

多顺反子mRNA：原核生物的一个mRNA分子通常包含多个功能相关的基因（一个操纵子），同时被转录和翻译。这意味着一个启动子的活性可以同时影响多个基因的表达。

产品优势

优势一

超高的RNA提取成功率：范本级样品制备流程，样本处理经验丰富，实验成功率高；

优势二

构建链特异性文库，数据质量高，表达定量和结构分析更准确：采用链特异性建库，承诺有效数据量，保证数据分析的可靠性；

优势三

分析内容丰富，除了基础的mRNA分析，还增加了非编码的分析，内容全面；

优势四

云分析，小工具操作简便实用性强。

工作流程

  • 建库测序

使用RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples（lexogen，USA）去除rRNA，将mRNA随机断裂成200bp左右的小片段，以mRNA为模板，利用随机引物反转录合成双链cDNA。在合成cDNA第二链时，用dUTP代替dTTP进行合成，合成的双链cDNA加入End Repair Mix将其补成平末端，5’端磷酸化，3’末端加上一个A碱基，连接Y字形测序接头。然后用UNG酶消除含有dUTP的cDNA第二链，从而使文库中只包含cDNA的第一链。使用Illumina（San Diego，CA）的Illumina® Stranded mRNA Prep, Ligation进行RNA文库构建。使用illumina测序仪（NovaSeq6000或其他新机型）进行RNA-seq双端测序。

原核转录组测序流程
  • 分析流程

测序数据下机后，使用百迈客云平台BMKCloud(www.biocloud.net)提供的生物信息学分析流程进行数据分析。将下机数据进行过滤得到Clean Data，与指定的参考基因组进行序列比对，随后进行文库质量评估、基因表达定量、差异表达分析、结构分析等。RNA-seq生物信息分析流程见下图：

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结果展示

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送样要求

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应用案例

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常见问题

1. 质检不合格的最常见原因？

答：（1）核酸浓度或总量不足；（2）杂质污染；（3）核酸降解。

2. 完成图 DNA 降解，质检结果及是否满足建库标准？

答：

严重降解：无清晰主带、条带弥散、无法建库。

中度降解：有清晰主带、有适度拖尾，且有 5 kb 以下大小的拖尾片段。质检判定为 C 不合格，可适用于风险建库。

轻度降解：有清晰主带、有轻度拖尾，且 5 kb 以下无拖尾片段。可建库测序。

3. 病原微生物样品是否要做特殊处理？

答：对于病原微生物，建议老师送抽提好的 RNA 样品，不建议接受病原微生物样品。

4. 什么是 RIN 值？

答：RIN 值（RNA integrity number）通常代表着 RNA 质量的高低，从 0~10，值越大就说明 RNA 的质量越高，完整性越好。它是由 labchip GX 仪器检测出来的。目前我们规定 RIN 值大于等于 4.5 的 RNA 样品属于合格样品。

5. RIN 值不合格是不是一定说明样品不合格？

答：不一定，对于一些特殊的样品，它们的标准峰图与典型的原核 RNA 峰图不一致。因此，样品检测 RIN 值即使不合格，但如果无明显降解、连续两批样品出现一致的情况，可认为是样品的特殊性造成的，可用于建库测序。

6.mapping比对率低怎么办?

  • 参考基因组选择不合适，此时建议重新查找正确的基因组。若实在没有合适的参考基因组，建议改为无参进行后续分析；
  • 其他物种污染(如病菌)等，若是本物种病菌的污染，建议剔除该样本；若是非本物种病菌的污染，建议联系公司处理;
  • 样品本身的问题(样本前期质量不高、物种本身参考基因组不好、实验处理为多个菌互作等)，此时若老师觉得跟自己的实验需求一样，则不需剔除样本。若已经严重影响了后续实验，建议剔除质量不高的样本或者剔除病菌/病毒的序列。

7.样本间重复性不好怎么处理?

  • 转录组的重复性是否好，是跟样品有着非常密切的关系。首先要明确自己的实验设计，如临床样本等， 由于个体之间差异巨大，可能本身就存在极大差异，若个体本身差异就大，有差异也是正常现象；
  • 从取样方面及RNA抽提质检方面考虑；
  • 转录组测序通常要求设置3个生物学重复样本，如果样本足够多，建议比预期实验设计多送1~2个样本测序，以便后续某个样品与组内其它样本出现离群情况，直接剔除离群样本，省时省力。若测序样本较少，无法剔除样本，也可以考虑对同一批次的备份样本再次测序，后续再重新分析；
  • 体现转录组重复性好坏的有三个分析：PCA，距离热图以及表达量聚类热图。

8.分析到的差异基因数目偏少，如何解决?

  • 根据样本重复性好坏(PCA和相关性热图)，建议客户剔除异常样本、重新分组后进行分析。
  • 若组内样本重复性较好，但可能由于处理之间差异性本身就不明显，可以通过调整参数（标准为：FDR≤0.05且|log2FC|≥1），通过降低差异基因的标准提高差异基因的个数，比如调整FDR为P-value，适当放宽差异倍数(将FC从2设置为1.5)，或者更换不同的分析软件进行重新分析。