微生物多样性

微生物多样性技术介绍

微生物多样性分析是以研究环境中微生物的种类和数量为目的,揭示随环境变化导致微生物群落结构变化的过程。其研究对象广泛,包括土壤、水体、发酵液、植物表面、动物胃肠道、皮肤等。

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研究对象

实验设计到信息分析一站式服务

提供全面的微生物多样性研究的方案设计和售后服务,丰富的标准分析以及个性化分析多角度阐明环境微生物变化规律。

  • 方案确定

  • 提取检测

  • 建库测序

  • 信息分析

  • 售后服务

技术策略与送样要求

 测序策略

Illumina Hiseq 2500 PE250测序

 DNA送样要求

DNA浓度 ≥10ng/μl(Qubit),DNA质量≥500ng(Qubit),DNA电泳条带清晰,无降解或者轻度降解。

环境样品取样方法及送样要求

粪便:清晨采集新鲜粪便样品,放于无菌离心管或其它无菌容器中,样品带回实验室后分装至无菌离心管或冻存管中,每份样品5g左右即可,液氮速冻3-5min-80°C长期保存,干冰运输送样。

肠道内容物:无菌条件下对动物个体进行处理,用75%酒精擦拭体表,用无菌解   剖剪剪开动物腹部,取出胃肠道等目的器官,用PBS进行清洗,离心收集沉淀,分装于2 mL离心管中;迅速置于液氮中冷冻 3~4 小时,然后转移至-80°C 或液氮中长期保存,干冰运输。

土壤:选取采样地点,可多点采样法进行取样,除去土壤表层未分解的凋落物层,采集土壤5g左右;样品带回实验室后过2mm 筛后;分装至无菌EP管或冻存管中,迅速置于液氮中冷冻 3~4 小时,然后转移至-80°C 或液氮中长期保存,干冰运输。

污泥:选取污泥样本于无菌离心管或其它无菌容器中,样品带回实验室后分装至无菌离心管或冻存管中,每份样品5g左右即可,液氮速冻3-5min-80°C长期保存,干冰运输送样。

水体:对于水质较为清澈(目测)的或微生物含量极其稀少的水样如:自来水、井水、泉水等,用采集回来的水样样品 1L 通过 0.22μm 的微孔滤膜真空过滤,水样中的总微生物被富集在滤膜表面,滤膜与无菌管中,液氮速冻,干冰运输。

发酵液:对于水质较为混浊的(或微生物含量较为丰富的发酵液)水样,三点水样混合摇匀后取80mL分装在两个无菌的50mL的离心管,每个分装40mL,防止分装过满,水样冰冻后体积膨胀,导致离心管破裂,被其它微生物群体污染。液氮速冻3-5 min-80℃保存。

皮肤:采用无菌棉签或无菌手术刀片轻轻刮取皮肤表面取样,取样后将棉签置于无菌的离心管,液氮速冻,-80℃长期保存;如果研究正常情况下皮肤微生物,取样前24h不能洗澡,不能使用润肤乳及抗菌活性的肥皂等。

产品优势与项目经验

丰富的项目经验与专业的信息团队,提供最全面准确的信息分析。

高水平分析团队

丰富的项目经验

全面的分析内容

专业的售后服务

数据质控

数据下机后根据PE reads之间的Overlap关系,将Hiseq测序得到的双端序列数据拼接(Merge)成一条序列Tags,同时对Reads的质量和Merge的效果进行质控,主要包括去除低质量Tags和去嵌合体

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物种注释

根据97%的相似度进行OTU聚类后,基于Silva(细菌)和UNITE(真菌)分类学数据库对OTU进行分类学注释,得到每个OTU对应的物种分类信息,进而在各水平(phylum,class,order,family,genus,species)统计各样品群落组成,绘制样品在各分类学水平下的群落结构柱状图,柱状图展示不同样品中物种的组成和相对丰度。

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)

PCA是一种分析和简化数据集的技术,通过将方差进行分解,将多组数据的差异反映在二维坐标图上,通过分析不同样品 OTU(97%相似性)组成可以反映样品的差异和距离,PCA运用方差分解,将多组数据的差异反映在二维坐标图上,坐标轴取能够最大反映方差的两个特征值。图中两个样品距离越近,则表示这两个样品的组成越相似。

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Alpha多样性分析

Alpha多样性(Alpha diversity)反映的是单个样品内部的物种多样性,有多种衡量指标:Chao1AceShannonSimpson。Chao1和Ace指数简单的反映出群落中物种的数量;Shannon和Simpson指数用于衡量群落多样性,受样品群落中物种丰度和物种均匀度(Community evenness)的影响。Chao1、Ace、Shannon指数值越大,Simpson指数值越小,说明样品的物种多样性越高。另外还统计了样本文库的覆盖率 Coverage,其数值越高,则样本中序列被测出的概率越高,而没有被测出的概率越低。

Beta多样性分析

Beta多样性分析主要采用 binary jaccardbray curtisweighted unifrac(限细菌)、 unweighted unifrac (限细菌)等4种算法计算样品间的距离从而获得样本间的β值。这四个算法主要分为两大类:加权(Bray-Curtis和Weighted Unifrac)与非加权(Jaccard和Unweightde Unifrac)。利用非加权的计算方法,主要比较的是物种的有无;而加权方法,则需要同时考虑物种有无和物种丰度两个问题。样品间距离越小,说明两个群体的物种组成越相似。

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LEfSe分析

LEfSe(Line Discriminant Analysis (LDA) Effect Size)分析主要用于发现不同组间具有统计学差异的Biomarker,根据设定的Biomarker筛选标准(LDA score>4)找出符合条件的Biomarker。

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16S功能预测

16S功能预测基于PICRUSt软件通过比对16S测序数据获得的物种组成信息,推测样本中的功能基因组成,从而分析不同样本或分组之间在功能上的差异。

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genus

相关性分析

网络图是相关性结果的一种表现形式,根据各个物种在各个样品中的丰度以及变化情况,使用sparcc算法进行相关分析,图中线的粗细代表相关性的强弱;线的颜色表示相关性:红色代表正相关,绿色代表负相关。

Q1.微生物多样性中OTU是指什么?

OTU(Operational Taxonomic Unit )即分类操作单元,是在系统发生学研究或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,人为给某一个分类单元(品系,种,属,分组等)设置的同一标志。在微生物多样性分析中,根据不 同的相似度水平,对所有序列进行OTU划分,一般情况下,如果序列之间的相似性高于97% (种水平)就可以把它定义为一个OTU,每个OTU代表一个物种。

Q2.Beta多样性四种距离算法的差异?

Beta 多样性分析主要采用 binary jaccard bray curtis unweighted Unifrac(限细菌)weighted Unifrac (限细菌)4种算法计算样品间的距离,那么这四种算法都有什么差别呢?

非加权的计算方法,主要考虑的是物种的有无,即如果两个群体的物种类型都一致,表示两个群体的样本距离最小;加权方法,则同时考虑物种有无和物种丰度两个问题。比如如样品A3个物种a2个物种b组成,样品B2个物种a3个物种b组成,则通过非加权方法计算,因为样品A与样品B的物种组成完全一致,都只由物种ab组成,因此它们之间的样本距离为0。但通过加权方法计算,虽然样品A与样品B的物种组成一致,但物种ab的数目却不同,因此两个群体的β多样性则并非一致。

基于独立OUT的方法认为OTU之间不存在进化上的联系,每个OTU间的关系平等;基于系统发生树计算的方法,会根据16s的序列信息对OTU进行进化树分类, 因此不同OTU之间的距离实际上有“远近”之分。

Q3.PCA与PCoA的区别?

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一种分析和简化数据集的技术,通过将方差进行分解,将多组数据的差异反映在二维坐标图上;主坐标分析法(Principal coordinates analysis,PCoA)是一种与 PCA 类似的降维排序方法。PCoA与PCA的区别在于PCA是基于原始的物种组成矩阵所做的分析,使用的是欧式距离,仅仅比较的是物种丰度的不同,而PCoA首先根据不同的距离算法计算样品之间的距离,然后对距离矩阵进行处理,使图中点间的距离正好等于原来的差异数据,实现定性数据的定量转换。