微生物多样性测序分析

精准解析微生物种属水平上的组成和丰度

产品介绍

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微生物多样性测序

微生物多样性测序是对环境样品中细菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA进行特定长度的PCR扩增并对扩增产物进行测序的分析，可实现对环境样品中的优势物种、稀有物种和一些未知物种进行检测，精准解析微生物在种属水平上的组成和丰度情况，是当前研究环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段。

细菌微生物多样性

16S rDNA测序：16S rDNA具有10个保守区和9个高变区。保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异。对16S rDNA某个高变区进行测序，用于研究环境微生物中的群落结构多样性。

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16S rDNA序列及常用扩增引物序列

真菌微生物多样性

18S rDNA测序：18S rDNA也包含可变区和保守区。对18S rDNA某个高变区进行测序，用于研究环境样本中真核微生物群落结构多样性。

ITS1测序：ITS分为两个区域：ITS1和ITS2。ITS区域进化速率是18S rDNA的10倍之多。对ITS1和ITS2进行测序，用于研究环境样本中真核微生物群落结构多样性。

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ITS rDNA序列及常用扩增引物序列

功能基因多样性

功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到广泛关注的一类微生物，如硝化细菌、反硝化细菌、氨氧化细菌、硫酸盐还原菌、固氮菌等，使这些功能细菌发挥这种特定功能的基因就称为功能基因，如AOA、AOB、nifH等。

功能基因测序，是根据复杂环境中具有特殊功能的微生物基因序列设计引物，用该引物进行PCR扩增，建库后进行高通量测序。功能基因测序可有效研究特定环境中的功能微生物物种信息，包括：功能微生物功能差异、分类和丰度等，并与每个采样点的环境因子相结合，可以同时分析环境因子与功能细菌群落结构的关系，因此对复杂环境中的微生物构成研究有重要的指导作用。

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 常见的功能基因及对应的引物列表如下（部分）：

分类 功能基因 引物名称 正向引物 (Forward) 反向引物 (Reverse)
C循环功能基因 mcra MLf/MLr GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT
pmoa pmoAf325/pmoAr643 TGGGGYTGGACCTAYTTCC CCGGCRCRACGTCCTTACC
N循环功能基因 nirS Cd3aF/R3cdR GTSAACGTSAAGGARACSGG GASTTCGGRTGSGTCTTGA
nosZ (GC)-nosZ 1840F/nosZ 2090R CGCRACGGCAASAAGGTSMSSGT CAKRTGCAKSGCRTGGCAGAA
nosz nosRB/nosLB CCCGCTGCACACCRCCTTCGA CGTCGCCSGAGATGTCGATCA
nosz nosZF/nosZ1622R CGYTGTTCMTCGACAGCCAG CGSACCTTSTTGCCSTYGCG
nifh nifh3/nifh4 TTYTAYGGNAARGGNGG ATRTTRTTNGCNGCRTA
nifh PolF/PolR TGCGAYCCSAARGCBGACTC ATSGCCATCATYTCRCCGGA
nirk (F1aCu)nirKF/(R3Cu-GC)nirKR ATCATGGTSCTGCCGCG GCCTCGATCAGRTTGTGGTT
narG narG-1960m2f/narG-2050m2r TAYGTSGGGCAGGARAAACTG CGTAGAAGAAGCTGGTGCTGTT
nifh nifH-F/nifH-R AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT
aoa amoA26F/amoA417R GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG
aob amoA-1F/ amoA-2R GGGGTTTCTACTGGTGGT CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC
com-amoA Ntsp-amoA162F/Ntsp-amoA 359R GGATTTCTGGNTSGATTGGA WAGTTNGACCACCASTACCA
P循环功能基因 phod ALPS-F733/ ALPS-1083 TGGGAYGATCAYGARGT CTGSGCSAKSACRTTCCA
S循环功能基因 arsC amlt-42-f/amlt-376-r TCGCGTAATACGCTGGAGAT ACTTTCTCGCCGTCTTCCTT
arsM arsMF1/arsMR2 TCYCTCGGCTGCGGCAAYCCVAC CGWCCGCCWGGCTTWAGYAC
植物鉴定 rbcL1 rbcLbF/rbcL717R AGACCTWTTTGAAGAAGGTTCWGT CATGTACCTGCAGTAGCATTCAAGT
matK1 matK−472F/matK−821R CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC TTTCCTTGATATCTAACATAATG

技术路线

微生物多样性测序技术路线图

测序平台与送样要求

测序策略

Illumina NovaSeq测序平台

真迈-SURF 3000测序平台

 DNA送样要求

DNA浓度≥1ng/ul，总量≥30ng，DNA电泳条带清晰，无降解或者轻度降解。

环境样品取样方法及送样要求

环境样品 送样要求 保存及运输
普通土壤 除去土壤表层未分解的凋落物层、动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品捣碎，过2mm筛后，分装至2mL或更大体积的EP管或冻存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g。 样本-80℃或液氮中长期保存，干冰运输
根际土壤 收集植物植株，去除根部大块土壤；摇动植株去除附着不紧密的土壤，使用无菌刷子收集根部附着紧密的土壤；随机多点取样5-10g，过2mm筛后，分装至2mL或更大体积的EP管或冻存管中；每管土壤含量大概0.25~0.5g，需保证送样量在1~2g。
粪便 无菌牙签或粪便取样器截取样品中段内部（避免表层中的肠道膜脱落细胞），外部容易污染且细菌DNA由于接触空气可能有降解。将已取的粪便样品分装至2mL EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管粪便量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份。
肠道内容物 在实验对象死亡后，无菌条件下，取出整个肠道，用无菌解剖刀切取所需肠段的，用无菌手术刀挖取内容物分装至2mL EP管（无菌）或冻存管（无菌）中，每管组织量为0.5~2g，每个样品分装2~3管备份
水体 过滤大量低微生物含量的清亮水样用0.22μm 的聚苯醚砜滤膜，每个样本至少1L水样。浑浊水样使用0.22μm滤膜过滤缓慢容易堵塞时，建议使用0.45μm的混合纤维素酯滤膜，每个样本0.5L-1L水样；如果水样中不可溶解的颗粒较多，需要使用2-5μm孔径的滤膜将不可溶解的颗粒杂质滤去，再使用0.22μm或0.45μm的滤膜富集菌体，每个样本0.5L-1L水样。
空气 开动采样仪（浮游细菌采集器），使被测空气滤过凝胶膜（灭菌），空气中的浮游菌被截留在凝胶膜上（过滤时间越长，收集的空气中的灰尘越多，菌数量越多），收集完成后取下滤膜。

产品优势与项目经验

高水平分析团队

丰富的项目经验

全面的分析内容

专业的售后服务

结果展示

物种注释
物种注释
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RDA分析
相关性分析
相关性分析
1
LEfSe分析

成功案例展示

成功案例展示

常见问题

Q1.微生物多样性中OTU是指什么？

OTU（Operational Taxonomic Unit ）即分类操作单元，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。在微生物多样性分析中，根据不 同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，一般情况下，如果序列之间的相似性高于97% （种水平）就可以把它定义为一个OTU，每个OTU代表一个物种。

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Q2.Beta多样性四种距离算法的差异？

Beta 多样性分析主要采用 binary jaccard、 bray curtis、 unweighted Unifrac(限细菌)、weighted Unifrac (限细菌)等4种算法计算样品间的距离，那么这四种算法都有什么差别呢？

非加权的计算方法，主要考虑的是物种的有无，即如果两个群体的物种类型都一致，表示两个群体的样本距离最小；加权方法，则同时考虑物种有无和物种丰度两个问题。比如如样品A由3个物种a和2个物种b组成，样品B由2个物种a和3个物种b组成，则通过非加权方法计算，因为样品A与样品B的物种组成完全一致，都只由物种a和b组成，因此它们之间的样本距离为0。但通过加权方法计算，虽然样品A与样品B的物种组成一致，但物种a和b的数目却不同，因此两个群体的β多样性则并非一致。

基于独立OUT的方法认为OTU之间不存在进化上的联系，每个OTU间的关系平等；基于系统发生树计算的方法，会根据16s的序列信息对OTU进行进化树分类， 因此不同OTU之间的距离实际上有“远近”之分。

Q3.PCA与PCoA的区别？

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)是一种分析和简化数据集的技术，通过将方差进行分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上；主坐标分析法(Principal coordinates analysis,PCoA)是一种与 PCA 类似的降维排序方法。PCoA与PCA的区别在于PCA是基于原始的物种组成矩阵所做的分析，使用的是欧式距离，仅仅比较的是物种丰度的不同，而PCoA首先根据不同的距离算法计算样品之间的距离，然后对距离矩阵进行处理，使图中点间的距离正好等于原来的差异数据，实现定性数据的定量转换。

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