10x Genomics单细胞转录组测序分析

解决单细胞分离捕获、极低量 RNA 反转录扩增

产品介绍

单细胞转录组测序(Single cell RNA sequencing)是在单细胞水平对转录组进行测序的一项新技术,可以研究单个细胞内的基因表达情况,同时解决用组织样本测序无法解决的细胞异质性难题,让解析单个细胞的行为、机制及其与机体的关系成为了现实。

10 X Genomics单细胞转录组测序平台利用微流控、油滴包裹和baecode标记等技术来实现高通量的细胞捕获技术,能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞,从而获得每个细胞的3’端的转录组信息。具有细胞通量高、建库成本低、捕获周期短等优势。该技术主要用于细胞分型和标记因子的鉴定,从而实现对细胞群体的划分与细胞群体间基因表达差异的检测,此外该技术还可以预测细胞分化与研究发育轨迹,在当下疾病、免疫、肿瘤领域以及组织、器官、发育研究中发挥越来越重要的作用。

10X genomics工作流程

Gel Bead-In-EMulsions

10X genomics信息流程

单细胞测序平台系统集成:细胞分离捕获,微流控芯片扩增,数据分析。解决单细胞测序两大难点:单细胞分离捕获,极低量 RNA 反转录扩增。整体的项目流程从样品接收到项 目交付如下图:

结果展示

2
细胞分化轨迹分析示例图
Marker gene鉴定示例图
Marker gene鉴定示例图
3
细胞亚群鉴定示例图
4
tSNE降维聚类分析示例图

常见问题

如何确定 cluster 的具体细胞类型?

1、根据已知的 marker gene 来确定: 根据之前的经验和文献记载,已知某一些细胞类型会特异表达一些 marker gene, 比如 T 细胞中特异表达的 CD3/CD4,B 细胞中表达的 CD19/CD20 等。

1)根据 marker gene 在 cluster 细胞中的表达情况来确定:利用 Loupe Cell Browser 或其他软件,标记 cell 中表达 marker gene 的情况,来推测哪个 cluster 是某种细胞类型。

2)根据软件鉴定到的差异表达基因或者 marker gene 来确定:Cell-Ranger 与 monocle2(或其他单细胞分析软件)均提供 cluster 差异表达基因的结果,如果已知某种细胞的Marker gene,可以在差异基因列表中寻找,是否存在这些 marker gene,从而推测该cluster 是否为某种细胞类型。

2、根据基因所在功能通路确定: 不清楚具体的 marker gene,或者某些 cluster 找不到已知的 marker gene。根据cluster 中差异基因或者共表达基因所在 KEGG 和 GO 通路,推测细胞的功能。

拟时间分析有何用?

在很多生物进程中,细胞并不是全部同时处于同一个时期的。利用单细胞基因表达研究 细胞分化时,捕获到的细胞通常处于范围较广的不同时期:某些细胞细胞还未开始分化,某些处于中间状态,而另一些可能已经分化结束。所以整体看来,样品中的各个细胞基因表达波动较大,研究起来十分复杂。拟时间分析根据基因表达量信息,计算细胞与细胞时间的距离,估算出将所有细胞排列到其拟时间进程后的总最短路径,帮助了解样品中细胞的种类与细胞分化的过程。

报告中 Cell-Ranger、monocle2 或其他软件的分析结果是什么关系?

各个软件的分析是独立的,虽然其中的具体分析内容存在交集,比如细胞聚类,差异基因鉴定,功能注释等,但不同软件的算法是不一样的,在查看结果进行后续解读时,切记不要弄混。

Cell-Ranger 是 10x 官方提供的分析软件,其结果主要包括在原始的网页报告中,分析内容较少,而且可修改以及定制化分析的余地较小;monocle2 是目前主流的单细胞分析软件包,由华盛顿大学的 Cole Trapnell(之前 TopHat 和 Cufflinks 的作者)开发,涵盖单细胞分析中的绝大部分,脚本相对较为灵活,可根据具体的要求对参数和方法进行修改,以获得最佳的结果;此外,还可以提供 SC3 软件的分析,根据后续项目个性化的要求,对结果进行调整,或者重分析。

不同软件的分析内容,结果展现形式,均存在一定的差异,具体采用哪一套分析的结果, 主要依赖客户根据自身要求,以及结果与预期的相符合程度进行挑选。

相关文章