分类： 质谱检测
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当前茶叶资源存在浪费问题，大量粗老茶叶因品质不佳被废弃，亟需高值化利用技术。外源接种灵芝发酵可有效提升茶叶风味与品质。咖啡因等生物碱是茶叶苦味核心，其代谢直接决定口感，但现有研究仅关注单一代谢物，未从蛋白-代谢层面解析灵芝调控生物碱的机制，缺乏分子证据。

近日，西南大学联合贵州省茶叶研究所在著名期刊Food Research International上发表了一篇题为“Metabolomic and proteomic analysis reveals the metabolic changes of alkaloids in Ganoderma lucidum fermented tea”的研究。本研究采用广靶代谢组、TMT标记定量蛋白组结合PRM靶向验证的技术方案，建立“代谢-蛋白”关联网络，填补现有研究缺口，为粗老茶叶高值化利用及灵芝发酵调控茶叶品质提供理论支撑。百迈客生物为该研究提供了TMT蛋白质组和PRM蛋白质组检测服务！文章题目：Metabolomic and proteomic analysis reveals the metabolic changes of alkaloids in Ganoderma lucidum fermented tea

期刊名称：Food Research International

影响因子：8

发表时间：2026年4月

发表单位：西南大学、贵州省茶叶研究所

研究方法：广靶代谢组+TMT蛋白质组+PRM蛋白质组

研究思路

材料方法

1.实验材料

  • 原料：黔湄601绿茶（粗老叶）
  • 菌种：灵芝“梵芝1号”
  • 样品：发酵0d/5d/10d/15d/20d+干燥成品GLFT

2.核心技术

  • 代谢组：UPLC-QTRAP-MS/MS，广靶检测次生代谢物
  • 蛋白组：TMT标记定量，鉴定差异表达蛋白
  • 靶向验证：PRM平行反应监测，验证关键蛋白
  • 数据分析：PCA、差异筛选、KEGG/GO富集、相关性分析
  • 感官评价：5人专业评审团，对茶叶外形、汤色、香气、滋味等评分

研究结果

1、灵芝发酵茶制备流程

  • 流程：菌株驯化→绿茶灭菌→接种→25℃发酵20d→70℃干燥→GLFT成品
  • 关键：灵芝经茶汁梯度驯化，适配茶叶环境，发酵更稳定。

图1 GLFT生产工艺示例展示

2、代谢物整体变化特征

  • 共鉴定2155种次生代谢物，生物碱占10.4%。
  • PCA显示：未发酵样（F0d）与发酵样显著分离，不同发酵阶段样本聚类清晰，数据可靠。
  • 差异代谢物：共筛选832种；发酵期以下调为主，干燥期大量上调积累。

图2 代谢物变化总结

3、生物碱及关联代谢物动态

  • 筛选11种关键差异生物碱：咖啡因、茶碱、可可碱、甜菜碱、N-甲基烟酸等。变化规律：
  • 嘌呤类（咖啡因/茶碱/可可碱）：发酵期逐渐积累，15–20d达峰，干燥后略降。
  • 甜菜碱：持续下降，GLFT最低。
  • N-乙基金雀花碱/千里光宁：发酵期稳定，干燥后骤升。
  • KEGG富集：主要富集在咖啡因代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路。

图3 加工过程中生物碱及其相关代谢物的相对含量变化，B代谢物富集气泡图

4、蛋白组整体变化

  • 共鉴定3031种蛋白，筛选1207个差异蛋白。阶段特征：
  • 0–5d：差异蛋白最多，灵芝作用最剧烈，蛋白以合成为主。
  • 5–10d：差异蛋白最少，过程平稳。
  • 15–20d、干燥期：蛋白以下调降解为主。
  • 功能注释：GO/KEGG/COG三库共注释877个核心蛋白，构成发酵调控网络。

图4 A.不同发酵组间蛋白质含量差异的比较；B.加工过程中样品蛋白质信息的PCA图；C.所有蛋白质GO注释；D.所有蛋白质COG注释；E.所有蛋白质KEGG注释；F.三个数据库注释结果的韦恩图

5、生物碱-关键蛋白关联

  • 筛选24个生物碱代谢核心差异蛋白。关键蛋白：
  • UOX（尿酸氧化酶）：调控咖啡因等嘌呤生物碱代谢。
  • SHMT（丝氨酸羟甲基转移酶）：通过甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸通路间接调控生物碱。
  • 甜菜碱、N-甲基烟酸相关蛋白：集中在氨基酸代谢、氧化还原、氮代谢通路。
  • 相关性：多数蛋白与对应生物碱显著正相关，部分呈负相关。

图5 A.生物碱代谢物与关键差异表达蛋白之间的相关性分析；B.展示部分关键蛋白与某些生物碱代谢物之间相关性的桑基图；C.展示部分关键蛋白与某些生物碱代谢物之间相关性的桑基图；D.展示部分关键蛋白与某些生物碱代谢物之间相关性的桑基图

6、PRM靶向验证

  • 对30个关键蛋白靶向定量，18个显著差异。

核心蛋白：

  • VOC结构域蛋白、叶绿体核糖体循环因子：发酵初期极显著上调，参与氧化应激响应。
  • SHMT（A0A7J7H649、A0A7J7I2J8）：变化最显著，证实其在氨基酸-生物碱代谢中的核心作用。
  • 结论：PRM结果与TMT蛋白组高度一致，数据可靠。

图6 A.PRM分析流程；B.目标蛋白相关性分析；C.目标蛋白PCA分析

7、生物碱代谢通路全景

  • 核心枢纽：乙醛酸代谢连接咖啡因降解、甜菜碱转化、精胺合成。

关键流向：

  • 咖啡因→1,3,7-三甲基尿酸→乙醛酸循环
  • 甜菜碱→甘氨酸→氨基酸/生物碱前体
  • 腐胺→N-甲基烟酸→吡啶类生物碱
  • 机制：灵芝通过调控氨基酸代谢，间接重塑生物碱谱，降低苦涩、优化风味。

图7 咖啡因及其他生物碱代谢途径

研究总结

  • 品质提升：灵芝发酵让粗老绿茶感官评分从79.8升至91.1，汤色红亮、滋味甜醇、无苦涩。
  • 代谢规律：发酵重塑生物碱组成，嘌呤生物碱适度积累，甜菜碱持续下降，干燥驱动特征物富集。
  • 核心机制：24个关键蛋白（尤其是SHMT、UOX）通过氨基酸代谢通路，间接调控生物碱转化。
  • 应用价值：为灵芝发酵茶品质精准调控、粗老茶叶高值化提供理论与分子靶点。
  • 科学创新：首次建立“灵芝发酵-蛋白调控-生物碱代谢”的关联网络，填补真菌-茶叶互作机制空白。

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