【案例解读】蛋白组学iTRAQ和label-free的技术应用

遗传物质从DNA、RNA到蛋白质的过程,受到不同水平的表达调控,如表观调控、转录调控、翻译调控等。蛋白质是生理活动的执行者,是生命现象的直接体现者,蛋白质组学的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。同时结合mRNA的研究可以比较分析基因在转录和翻译不同水平的调控机制。
iTRAQ和label-free是目前定量蛋白质组学常用的技术。其中,iTRAQ技术是一种蛋白体外标记定量技术,利用多种同位素特异性标记蛋白的氨基集团,进行质谱串联分析,从而比较不同样品蛋白质的相对含量。另外非标定量法(label-free)是一种不依赖于同位素标记的新型蛋白质定量技术,通过比较质谱分析次数或质谱峰强度,分析不同样品蛋白的数量变化。相比于label-free,iTRAQ的蛋白通量及结果准确性都更高。今天咱们通过实际案例来具体了解一下它们的用途。

案例一: Proteomic analysis reveals strong mitochondrial involvement in cytoplasmic male sterility of pepper (Capsicum annuum L.)
实验方法:Label free
发表杂志:Journal of Proteomics,IF:3.867
见刊时间:2017.8
样本:辣椒花蕾
文章概述:这是一篇很典型的应用label-free蛋白质组学方法研究花粉发育和雄性不育相关分子机制,共定性定量了324个差异表达蛋白,组织学实验表明花粉中绒毡层细胞的程序化凋亡是雄性不育的最重要的原因。蛋白质组学的生物信息分析结果表明参与花粉外壁形成、丙酮酸代谢、三羧酸循环、线粒体的电子传输及氧化应激反应都可能和细胞败育有关。我们的研究为研究辣椒育种提供了研究的基础。

案例二: ProteomeAnalysis of Potential Synaptic Vesicle Cycle Biomarkers in the Cerebrospinal Fluidof Patients with Sporadic Creutzfeldt–Jakob Disease
实验方法:iTRAQ
发表杂志:Molecular Neurobiology(分子神经生物学),IF:5.397
见刊时间:2016.8.25
样本:脑脊液
文章概述:克雅氏病是一种致命的神经退行性疾病,发病迅速,至今仍不明确它的发生机制;而突出囊泡通路被认为与许多神经性疾病相关。研究者选用了20例克雅氏病病人和13例正常人的脑脊液,进行了iTRAQ差异蛋白质组学研究,从中筛选出了在疾病中表达异常的蛋白。从而筛选得到了参与该病发展突触囊泡循环通路中的潜在分子标志物。研究结果发现突触囊泡通路在克雅氏病中发挥着重要作用,并且通过蛋白质组学的技术手段,鉴定到了参与此通路的6个关键蛋白:AP2A1,SYT1,SNAP25,STXBP1,CLTB,Rab3a,紧接着利用Western Blot的方法验证了这些蛋白的表达量差异。借助这项研究,研究者们希望能够帮助筛选明确的分子标志物,来帮助预测sCJD的发生。

案例三:iTRAQ-based quantitative proteomic analysis for identification of biomarkers associated with emodin against severe acute pancreatitis in rats
实验方法:iTRAQ
发表杂志:RSC Advances,IF:3.108
见刊时间:2016.6
样本:大鼠
文章概述:本文是一篇很典型的利用蛋白质组学技术(iTRAQ)发表在Royal Society of Chemistry上的文献,研究大鼠SAP造模后及大黄素治疗后蛋白质层面的表达差异,旨在筛选出大黄素对SAP作用的生物标记物。作者筛选出了32个潜在标记蛋白并对其进行了GO功能注释,接着将目光锁定在HTRA1这种新发现的标记物,并经过Western blot证实了其与SAP及大黄素的密切关系。最后提出了大黄素通过抑制HTRA1/TGF-β信号通路来治疗SAP的假说,为揭示大黄素对SAP治疗的分子机制提供了新的思路。

案例四:Comparative transcriptomic and proteomic analyses provide insights into the key genes involved in highaltitude adaptation in the Tibetan pig
实验方法:RNA-seq, iTRAQ质谱定量分析,
发表杂志:Scientific Reports,IF:5.228
见刊时间:2017.6
样本:猪的心脏组织
文章概述:本文是一篇很典型的利用转录组测序技术和蛋白质组学技术(iTRAQ)发表在Scientific Report上的文献,研究高原地区和平原地区藏猪和约克郡猪心脏组织的转录组和蛋白组的差异。旨在研究高原动物适应极端环境的机制。多组学联合方式揭示了环境适应分子机制的关键蛋白A2M, PDLIM3, CRYAB, ACE及参与的信号通路HIF-1,心血管发育,VEGF等信号通路,这些信号通路可以与藏猪的环境适应机制有关,为了解人类缺氧性相关疾病的发病机制提供了很重要的参考。

案例五:Comparative proteomics to reveal muscle-specific beef color stability of Holstein cattle during post-mortem storage
实验方法:Label free
发表杂志:Food chemistry IF:4.052
见刊时间:2017
样本:牛肌肉
文章概述:本文利用了非标记定量(Label free)蛋白质组学的方法,研究发现,腰大肌在宰后贮藏过程中的高铁肌红蛋白明显高于背最长肌,但后者的肉色保持较好。生物信息学分析发现,背最长肌的丰度较高的蛋白主要与抗氧化、保护和修护有关,而腰大肌的丰度较高的蛋白,主要比TCA循环、线粒体电子传递链相关,从而导致了两者肉色变化的差异性。

案例六: Unraveling proteome changes of Holstein beef M. semitendinosus anditsrelationship to meat discoloration during post-mortem storage analyzedbylabel-free mass spectrometry
实验方法:Label free
发表杂志:Journal of Proteomics IF:3.867
见刊时间:2016
样本:牛半腱肌
文章概述:
本文利用了非标记定量(Label free)蛋白质组学的方法,探究牛半腱肌在不同储存时间(0天、4天和9天)其蛋白组的变化,同时寻找与肉色变化相关的差异蛋白。研究发现,宰后贮藏过程中牛肉色逐渐劣变,高铁肌红蛋白的含量不断上升,肉色由鲜红色转变成褐色。不同储存天数下,共找到了118个差异蛋白质,其中18个差异蛋白质与牛肉的颜色联系密切,生物信息学分析发现,这些蛋白主要与糖酵解、能量代谢、电子传递和抗氧化功能等生物进程相关。

案例七: Comparative Proteomics Analysis of Phloem Exudates Collected during the Induction of Systemic Acquired Resistance
实验方法:Label free
发表杂志:Plant Physiology IF:6.456
见刊时间: 2016
样本:拟南芥
文章概述:系统获得抗性Systemic acquired resistance(SAR)是植物受到局部感染初期产生的一种防御反馈,它为未受感染的区域提供了长效的、全局性的抗病保护。研究人员以拟南芥的韧皮部汁液为研究对象,选取了空白组(Mock)、高病毒感染组(virulent Pst)、低毒感染组( avirulent Pst )用于高通量定量蛋白组学的实验分析。富集到与 SAR 相关的蛋白如 THIOREDOXIN h3,ACYL-COENZYME A-BINDING PROTEIN6 , PATHOGENESIS-RELATED1,同时也发现一系列与SAR相关的新蛋白,此外,研究人员除了富集拟南芥SAR过程的信号通路,还将鉴定到的韧皮部汁液蛋白组与数据库中南瓜和矢车菊的韧皮部汁液蛋白组数据做了比较,发现尽管物种间鉴定到的蛋白组差异较大,但在SAR调控下的蛋白确有相通之处!

案例八:Quantitative proteomics and transcriptomics reveal key metabolic processes associated with cotton fiber initiation
实验方法:iTRAQ+RNA-seq
发表杂志:Journal of Proteomics IF:3.867
见刊时间:2015
样本:棉花胚珠
文章概述:
利用iTRAQ蛋白质组学技术和RNA seq技术,揭示参与棉花纤维形成的关键代谢通路。共鉴定并量化了5884种可能参与纤维细胞起始的蛋白质。发现了两个编码3-羟基酰基-CoA脱水酶的棉花PAS2基因。 VLCFA生物合成通过关键基因的转录激活来调控纤维的生长和发育。 本研究提供了纤维初始细胞的转录组学和蛋白质组学数据,增加了对控制纤维细胞分化和早期棉花纤维发育的分子过程的理解。
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