导读
研究背景：
宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的第四大原因。全世界每年报告的新病例超过500000例（Torre等人，2015年）。尽管目前可用的治疗方法，如化疗、根治性子宫切除术和放疗，显示出有希望的结果，但由于此类治疗的强烈副作用，每年还是大约有30万人死亡（Franco等人，2001年）。
因此，迫切需要探索能够有效治疗宫颈癌且副作用最小的新分子（Smith等人，2007）。
莎草L.（莎草科），已被证明具有广泛的生物和药理功能，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗雄激素、抗癌、抗惊厥、抗糖尿病和止泻活性（Kamala et al.，2018；Pirzada et al.，2015）。香附子的主要活性成分是挥发油，包括多种单萜、倍半萜和氧化物。α-Cyperone是香附子根茎中主要的天然倍半萜之一，约占总挥发油的20%（Soumaya-Kilani et al.，2008）。体外实验表明，α-Cyperone具有抗炎作用（Hu等人，2017）。在LPS刺激的RAW 264.7细胞中，α-Cyperone通过NF-κB信号通路的负调控抑制促炎因子COX-2和IL-6的表达（Jung等人，2013）。巧合的是，α-Cyperone通过激活Akt/Nrf2/HO-1和抑制神经调节的NF-κB信号通路来抑制LPS诱导的BV-2细胞的炎症（Huang等人，2018）。
考虑到香附子在中药中常用于治疗妇科疾病（Paula et al.，2011），而α-Cyperone是香附子中最有前景的活性成分（Huang et al.，2018；Jung et al。2013），作者推测α-Cyperone可能在宫颈癌的防治中发挥重要作用。本研究旨在检测α-Cyperone对HeLa细胞是否具有抗肿瘤活性，并探讨其作用机制。
结论
结果表明，α-Cyperone能抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。从机制上讲，α-Cyperone通过线粒体凋亡途径促进HeLa细胞凋亡，细胞内活性氧（ROS）水平升高，细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶-3、PARP和Bax的表达上调。进一步的RNA测序显示α-Cyperone抑制HeLa细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活，PI3K抑制剂和激动剂证实了这一点。PI3K抑制剂（LY294002）与α-Cyperone协同抑制HeLa细胞的生长，而PI3K激动剂（IGF-1）则消除了这种作用。有趣的是，α-Cyperone和LY294002均能抑制PD-L1的表达，而IGF-1的补充则能挽救PD-L1的低表达。综上所述，作者的研究结果揭示了α-Cyperone对HeLa细胞生长的抑制作用是通过ROS介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路触发的，并且与PD-L1表达的下降密切相关。
英文题目：α-Cyperone inhibits the proliferation of human cervical cancer HeLa cells via ROS-mediated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.
期刊杂志：European Journal of Pharmacology
影响因子：3.623
原文链接：https://sci-hub.ren/10.1016/j.ejphar.2020.173355
材料与方法
材料：人宫颈癌细胞HeLa；
Keywords：RNA-seq；
实验结果
一、α-Cyperone抑制HeLa细胞增殖和抑制既落形成
用CCK-8法检测α-Cyperone对HeLa细胞体外活力的影响。在指定的时间（24、48和72小时）使用不同浓度的α-Cyperone处理HeLa细胞。如图1A所示，α-Cyperone对HeLa细胞增殖具有浓度和时间依赖性抑制作用。细胞毒作用48h的半数抑制浓度（IC50）值HeLa细胞为35.57±1.58μM。因此，作者在进一步的实验中选择了15、30和60μM的α-Cyperone。
在平板克隆形成试验中，与未经处理的对照组相比，经不同浓度（15、30和60μM）的α- Cyperone处理的HeLa细胞形成的集落更少且更小，这表明α- Cyperone以剂量依赖性方式降低HeLa细胞的集落形成能力（图1B）
图1
二、α-Cyperone诱导G1细胞周期阻滞
为了研究α-Cyperone是否抑制HeLa细胞的细胞周期进程，作者用不同浓度（0、15、30和60μM）的α-Cyperone处理细胞24小时，然后收集细胞进行细胞周期分析。结果表明，α-Cyperone处理使G1期细胞百分率增加，G1期细胞百分率分别增加6.17%、15.20%和21.30%（图2A）。采用westernblot检测cdc25A、cyclind1、CDK6、PCNA、p21和p27的表达水平，进一步探讨α-Cyperone对G1细胞周期阻滞的作用机制。作者发现α-Cyperone下调cdc25A、cyclind1、CDK6和PCNA蛋白水平，同时上调p21和p27蛋白表达（图2B）。
这些结果表明α-Cyperone诱导HeLa细胞G1细胞周期阻滞。
图2
三、α-Cyperone通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡
采用hoechst 33342染色法研究α-Cyperone对HeLa细胞凋亡的影响。如图3A所示，HeLa细胞呈现明亮的蓝色荧光，表明细胞核凝聚和DNA断裂。此外，annexin V/PI染色显示α-Cyperone以浓度依赖性方式将凋亡细胞百分比从5.64%增加到38.28%（图3B）。
线粒体膜电位的变化是细胞凋亡的典型事件（Suhaili et al.，2017）。在细胞凋亡过程中，线粒体膜被破坏，线粒体膜电位去极化，这可以通过降低JC-1实验中红绿色荧光强度比来衡量。如图3C所示，α-Cyperone诱导线粒体膜电位的剂量依赖性丧失。为了进一步证实凋亡细胞的死亡，作者检测了细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶-3、Bax、Bcl-2和PARP的蛋白表达。如图3D所示，α-Cyperone处理显著增加细胞色素c、caspase-3、PARP和Bax的表达。相反，Bcl-2表达降低。这些结果表明α-Cyperone通过线粒体凋亡途径诱导HeLa细胞凋亡。
图3
四、α-Cyperone诱导HeLa细胞氧化应激
如图4A所示，在浓度分别为15、30和60μM的α-Cyperone作用48小时后，Hela细胞产生的细胞ROS分别增加到30.12%、37.30%和94.67%。然后，作者进一步确定ROS抑制剂（N-乙酰半胱氨酸，NAC）预处理是否能保护HeLa细胞免受α-Cyperone的细胞毒作用。如4B所示，与α-Cyperone单独治疗组相比，NAC和α-Cyperone联合治疗可显著降低细胞色素c、Bax的表达，增加PCNA和Bcl-2的表达。结果表明，α-Cyperone诱导HeLa细胞生长抑制是通过破坏氧代谢平衡实现的。
图4
五、α-Cyperone抑制HeLa细胞PI3K/Akt/mTOR通路的激活
作者对HeLa细胞进行RNA测序分析。根据结果，发现与对照组相比，有656个显著上调基因和997个下调基因（图5A）。接下来，通过功能注释对这些差异基因进行聚类分析。结果表明，α-Cyperone影响了与癌症相关的多种生物途径，包括代谢途径、MAPK信号途径、PI3K/Akt/mTOR信号途径、细胞周期和凋亡（图5B，C）。
为了揭示α-Cyperone对HeLa细胞的抑制作用机制，作者通过westernblot评估了参与PI3K/Akt/mTOR通路的关键因子的磷酸化（图5D）。结果表明，与正常组相比，α-Cyperone作用48h后，HeLa细胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平明显下调。此外，还利用PI3K抑制剂（LY294002）和PI3K激动剂（IGF-1）进一步探讨了α-Cyperone（30μM）对HeLa细胞的作用。如图5E所示，LY294002（10μM）通过下调Bcl-2、caspase3、PCNA、p-Akt、p-PI3K和p-mTOR的蛋白水平来增强α-Cyperone诱导的细胞凋亡，与Bax和细胞色素c蛋白的上调一致。此外，IGF-1（100 ng/ml）减弱α-Cyperone诱导的细胞凋亡。
也就是说α-Cyperone通过PI3K/Akt/mTOR途径抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。
图5
许多研究表明，肿瘤细胞通过利用免疫检查点逃避宿主免疫监视，从而导致癌症的扩散、转移和复发（Pardoll，2012）。免疫检查点抑制剂（ICIs）主要通过阻断PD-1和PD-L1的结合来实现抗肿瘤作用（Brahmer等人，2012年）。作者的结果发现α-Cyperone抑制HeLa细胞中PD-L1的活化（图5D）。鉴于α-Cyperone抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活，作者进一步探讨了PD-L1与PI3K/Akt/mTOR信号通路的关系。结果显示，PI3K抑制剂（LY294002）抑制PD-L1的表达，而PI3K激动剂（IGF-1）增强PD-L1的表达（图5E）。因此，α-Cyperone通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制PD-L1的表达。
总结
本研究表明α-Cyperone通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对HeLa细胞的生长具有强烈的抑制作用。此外，α-Cyperone通过同样的途径抑制PD-L1的表达水平。这些发现揭示了α-Cyperone抗宫颈癌的机制，提示α-Cyperone的抗肿瘤活性可能与调节程序性细胞死亡配体1（PD-L1）有关。基于这些结果，α-Cyperone有望成为治疗宫颈癌的候选药物。
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