在三代测序技术创新开发方面,百迈客基于PacBio的Sequel Ⅱ平台,通过实验研发,在确保有高准确度和长读长优势的同时,大大提高了数据利用率,降低了成本。该产品迄今为止已参与研究近千个项目,成功开发近10万份样本,极大地促进了全长微生物多样性测序技术在微生物组科研领域内的普及。
近日,百迈客客户文章不断,喜报频频,在恭喜老师论文发表的同时,我们对文章进行了解读,分享给各位读者,本期分享的为两篇全长微生物多样性在小鼠肠道菌群研究的成功案例,希望能够为各位老师提供研究思路。

成功案例一:PacBio全长微生物多样性测序+代谢组学+细胞因子网络

期刊:Ecotoxicology and Environmental Safety

影响因子:6.291

近日,首都医科大学公共卫生学院和环境毒理学北京重点实验室在《Ecotoxicology and Environmental Safety》发表题为“Characterization of gut microbiota, metabolism and cytokines in benzene-induced hematopoietic damage”的研究论文,该论文通过PacBio全长微生物多样性测序,代谢组学和细胞因子网络等方法,研究了苯所致造血毒性小鼠肠道菌群、代谢和细胞因子的关键特征,为阐明苯致造血毒性的可能机制提供了新的思路。

研究背景

苯是一种普遍存在的环境和工业化学物质,被国际癌症研究机构(IARC 1982)列为第一类致癌物, 此前的研究已经证实,苯会导致各种与血液毒性相关的不良反应,包括全血细胞减少、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血,甚至急性髓系白血病。炎症可能参与了苯诱导的造血毒性,但肠道菌群、代谢紊乱和炎症与苯诱导的造血毒性的系统证据尚未报道。因此,本研究旨在(1)分析苯暴露30天后小鼠外周血细胞计数和造血干细胞的变化;(2)观察苯暴露30天后小鼠肠道菌群、代谢产物及细胞因子的变化;(3)探讨肠道菌群、代谢特征及细胞因子与造血损伤的关系。该研究初步揭示了苯致造血损伤的肠道菌群、代谢和细胞因子特征,为探讨苯致造血损伤的潜在机制提供了新的思路。

研究方法

试验对象:

6周龄雄性小鼠24只,随机分为4组(每组6只),每周皮下注射玉米油 (对照组)或5 mg/kg、25 mg/kg、125 mg/kg油苯混合物

检测方法:

盲肠内容物16s rRNA基因测序;

血浆样本UPLC-MS/MS检测;

白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和血小板(PLT)水平测定;

相对脏器重量测定;

流式细胞分选;

组织病理学评估;

测序平台:

Pacbio sequel II

研究结果

1.苯暴露后体重和相对脏器重量的变化

选用有白血病倾向的C57BL/6J小鼠,分别给予苯0.5 mg/kg、25 mg/kg、125 mg/kg剂量处理30天,建立苯致小鼠造血损伤模型。与对照组相比,暴露于苯的小鼠体重增加较慢,从第三周开始,各组之间有显著差异。用相对脏器重量评价苯暴露对小鼠肝、肺、心、肾、脾和胸腺的影响。发现苯暴露30天后,苯暴露小鼠的肝脏重量增加,并伴随着胸腺重量的降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)(图1C和H)。肺、心、肾、脾的相对脏器重量无显著差异(图1D-G)。


图1. 暴露30天后苯对小鼠的总体毒性(每组n=6)。

2.苯暴露对血液系统的损害

骨髓是苯暴露的主要靶器官,含有大量的造血干细胞。所有成熟的血细胞通常来源于造血干细胞( HSCs)。暴露于苯的小鼠股骨切片的H&E染色显示出造血损伤的迹象。苯暴露小鼠骨髓中有核细胞密度明显降低,主要表现为髓系造血细胞(WBC、RBC、巨核细胞和粒细胞)减少,细胞间隙增大,脂肪滴积聚,细胞肿胀。这些病理改变在125mg /kg苯组小鼠中更明显,而在对照组中则不明显(图2A)。为进一步研究苯暴露对造血细胞生长和自我更新的影响,采用流式细胞术定量检测造血干细胞LSK、多能祖细胞(MPPs)、长期造血干细胞(LT-HSCs)和短期造血干细胞(ST- HSCs)。这一结果表明,与对照组小鼠相比,接触苯后LSK和MPPs降低,而 LT-HSCs和ST- HSCs增加(图2B-E)。苯中毒是恶性肿瘤发生前的一种表现,其特征是全血细胞计数显著减少。该研究中,125 mg /kg苯组WBC、RBC、HGB和PLT水平显著降低(P<0.05)(图2F-I)。综上所述,LSK比5 mg/kg和25 mg/kg苯暴露组的血液学变化更敏感,表明LSK可能是对造血损伤反应的敏感指标。125 mg/kg苯暴露后,血液系统发生明显变化,并形成苯毒性模型。


图2.苯对小鼠造血系统的影响

3. 苯暴露小鼠肠道菌群失调

采集的新鲜盲肠内容物进行16S rRNA基因测序分析,结果表明,各组的Shannon曲线趋于饱和,表明测序数据的数量和深度足以反映大部分微生物信息(图3A)。在Venn图中显示了四组中共有和特有的OTUs(图3B)。在本研究中,433个OTU中有307个是所有组共有的。接触苯组和对照组之间的alpha多样性并没有导致微生物群落的差异(图3C)。值得注意的是,beta多样性结果显示,暴露苯组和对照组的植物区系组成和分布有显著差异(图3D)。通过LEfSe分析,在暴露于苯的小鼠和对照小鼠盲肠内容物中共鉴定出8个肠道微生物群,这些差异微生物群的相对丰度主要反映在属和种水平上的变化(图3E-F)。在属水平,与对照相比,125 mg/kg苯暴露组中Ruminiclostridium, Desulfovibrio 和 Family_-XIII_AD3011_group,5 mg/kg苯暴露组的Oscil-libacter相对丰度显著提高;而GCA-900066225和Candidatus_stoquefichus的丰度则显著降低(图4G)。在种水平,25 mg/kg苯暴露组Bacteroides_sartorii的丰度高于对照组,Anaerotruncus_sp的丰度呈相反的趋势(图4H)。

图3.苯暴露小鼠盲肠内容物肠道菌群分析(每组n=6)

4.苯暴露小鼠的代谢紊乱

使用绝对定量代谢组学研究了苯暴露30天后血浆代谢物的差异变化。如图4A所示,成功建立了PLS-DA模型,相似样本聚集显著。同时,分别用PLS-DA和Mann-Whitney U检验计算VIP值和P值。采用UPLC-MS/MS共鉴定了209种血浆代谢物,15种不同代谢物。在VIP>1和P<0.05阈值下,苯暴露小鼠与对照组之间的潜在生物标记物为羟基苯基乳酸),这些代谢物主要来自有机酸、脂肪酸、氨基酸、苯甲酸、肉碱、吲哚和苯丙酸(图4B和表S2)。15种不同代谢物的剂量效应关系如图4C所示。

图4.苯对小鼠造血系统的影响(每组n=6)
(A)采用偏最小二乘判别分析plot (PLS-DA)实现样本类别的预测。(B-C)鉴别和定量差异代谢物

5. 苯暴露对血浆细胞因子的影响

为了了解细胞因子网络在苯诱导的造血损伤中的作用,采用Luminex技术同时检测小鼠血浆中的23种细胞因子。结果表明,与对照组相比,只发现5 mg/kg组IL-5升高,而在25 mg/kg组中,除IL-5外,Eotaxin也发生了显著改变。随着苯暴露水平的升高,125 mg/kg苯暴露组IL-4、IL-5、IL-10、Eotaxin、MIP-1α和MIP-1β水平显著升高(表1)。

表一.测定不同剂量苯暴露组和对照组23种血浆细胞因子水平

6.肠道微生物群、代谢产物和细胞因子与造血损伤的相关性

为探讨不同肠道菌群、不同代谢产物、不同细胞因子与造血损伤的关系,研究者采用Spearman相关性分析,结果表明,造血损伤与Ruminiclostridium、Family_XIII_AD3011_group、Bacteroides_sartorii、Anaerotruncus_sp、GCA-900066225和Candidatus_stoquefichus有关,而与Desulfovibrio和Oscillibacter无相关性(图5A)。筛选得到12种与造血损伤相关的血浆代谢物,包括2-羟基-2-甲基丁酸、戊二酸、羟丙酸、2,2-二甲基琥珀酸、己二酸、甲基戊二酸、DPA、4-羟脯氨酸、β -丙氨酸、邻苯二甲酸、棕榈酰肉碱和羟基苯基乳酸(图5B)。筛选的差异细胞因子均与造血损伤相关,其中IL-5、IL-10和MIP-1α与造血损伤密切相关(图5C)。这些结果表明肠道菌群、代谢和细胞因子可能参与了苯诱导的造血损伤过程。

图5.肠道微生物群、代谢产物和细胞因子与造血损伤的相关性。
(A) 不同肠道菌群与造血损伤的相关性。(B)差异代谢物与造血损伤的相关性。(C)不同细胞因子与造血损伤的相关性。* P < 0.05。

前人文献表明TH2细胞分泌和产生了上调的细胞因子(如IL-4、IL-5和IL-10),并在机体中发挥重要的免疫作用。IL-5在苯暴露组和对照组表现出显著的剂量-反应关系,与造血损伤呈极显著负相关。分析表明与IL-5与Family_XIII_AD3011_group呈显著负相关,与Anaerotruncus_sp呈正相关(图6A)。此外,羟丙酸和己二酸与IL-5呈负相关,而4-羟脯氨酸与IL-5呈正相关(图6B),Family_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp的丰度变化分别与己二酸和4-羟脯氨酸呈显著负相关。综上所述,Family_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp可能调节了已二酸和4-羟脯氨酸的产生水平,这些代谢产物进一步激活TH2细胞大量分泌IL-5,引起促炎反应或免疫紊乱(图6D)。这可能是苯诱导造血毒性的初步潜在机制,有待进一步研究证实。

图6.肠道菌群、代谢产物和细胞因子与IL-5的相关性
(A)肠道差异菌群与IL-5的相关性。(B)差异代谢物与IL-5的相关性。(C)差异肠道菌群与差异代谢产物的相关性。(D)在苯诱导的血液毒性中可能涉及肠道微生物群、代谢产物和细胞因子的信号通路

研究结论

苯暴露30天后,小鼠的造血功能受损,在5 mg/kg (1.43 ppm)苯暴露水平下,造血干细胞优先改变于外周血细胞。在低苯暴露水平下,造血干细胞的改变可能是一个更敏感的指标。此外,作者系统地分析了苯诱导造血毒性过程中肠道菌群、代谢和细胞因子网络之间的关系,并提出了一些有意义的指标,包括2种肠道微生物(Family_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp),2种血浆代谢物(己二酸和4-羟脯氨酸)和促炎细胞因子IL-5。研究结果为肠道菌群-代谢-炎症在苯诱导的造血损伤中的作用提供了新的见解,未来需要通过功能研究进一步探索。

成功案例二:PacBio全长微生物多样性测序+qPCR+功能预测

期刊:Food&Function

影响因子:5.396

近日,百迈客与华南生物医学研究中心,福建师范大学合作,在《Food&Function》发表题“Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model”的研究论文,通过注射LPS诱导脓毒症建立小鼠模型,再利用PacBio全长微生物多样性测序,RT-qPCR检测,ELISA试剂盒检测等方法,研究了康普茶对脂多糖(LPS)诱导小鼠脓毒症及小鼠肠道微生态的保护作用,证实了康普茶作为一种新型抗炎药物的潜力。

研究背景

康普茶是一种传统且流行的发酵茶饮料,摄入康普茶对身体有益处。LPS常被用于腹腔注射建立脓毒症模型,脓毒症是一种危及生命的疾病,能引起全身炎症反应、免疫紊乱和多器官功能紊乱。康普茶是否能对脓毒症有预防作用?康普茶作用机制是怎样?这些问题是本篇文章要核心解决的问题,此次研究的结果为康普茶在预防脓毒症的潜在作用提供了证据,对脓毒症防治具有重要意义。

研究方法

实验对象:

特定无菌C57BL/L的成年小鼠,随机分为6组:①Sham(注射磷酸缓冲盐水,自由喝水),②FD(注射磷酸缓冲盐水,自由喝康普茶),③IA(注射磷酸缓冲盐水,康普茶灌胃100 μL/100g,每天),④LPS(注射LPS诱导脓毒症,自由喝水),⑤FD+LPS(注射LPS诱导脓毒症,自由喝康普茶),⑥IA+LPS(注射LPS诱导脓毒症,康普茶灌胃100 μL/100g,每天)。

检测方法:

①测定自制康普茶各项指标:还原糖、总多酚、有机酸、葡萄糖酸等;

②小鼠生理状况检测:监控体重、直肠温度、红细胞,白细胞计数、淋巴细胞等生理指标,并记录小鼠死亡率;术后6h后,收集小鼠血液供下一步分析;

③分子检测:肺组织采用RT-qPCR检测,ELISA试剂盒检测小鼠血样炎症因子,小鼠粪便使用全长微生物多样性分析(n=60),蛋白印迹分析。

测序平台:

PacBio Sequel II(百迈客,同时使用BMK Cloud进行生物信息分析)

 

研究结果

1.康普茶成分、小鼠模型及其生理功效

康普茶含有的成分,且康普茶对血液系统未造成任何损害。LPS组小鼠体征下降,其他五组小鼠体征相近;LPS组小鼠直肠温度下降,FD+LPS、IA+LPS组小鼠直肠温度下降后回升至正常值;康普茶使注射LPS的小鼠存活率上升。

2. 康普茶对LPS诱导脓毒症小鼠的影响

康普茶摄入降低LPS诱导脓毒症小鼠炎症因子水平、免疫细胞亚群水平。康普茶摄入改变LPS诱导脓毒症小鼠细胞因子的mRNA水平,肺组织病理学特征,康普茶摄入显著降低了LPS诱导脓毒症小鼠的肺部组织损伤程度。康普茶的摄入可以抑制LPS诱导脓毒症小鼠的NF-κB激活。


图1.A~F:六组小鼠肺部组织H&E染色显微镜图片,G:六组小鼠肺部损伤的量化评分

3. 康普茶对小鼠肠道微生物的影响

①组成分布分析
康普茶摄入对小鼠肠道微生物门水平分布产生了影响,不同组小鼠的肠道微生物群不同:在Sham组,乳酸杆菌属为生物标志物;在IA组中,弯曲杆菌属、法克兰菌属、瘤胃球菌科和脱硫弧菌属是生物标志物;在FD组中,普雷沃氏菌科属和未培养的细菌属为生物标志物。异种杆菌属是LPS组的生物标志物,FD+LPS组是幽门螺杆菌、白杆菌和真杆菌,杜博西菌和念糖菌是IA+LPS组的生物标志物。

图2.六组小鼠肠道微生物组成分布分析

②相关性分析

计算6组间差异,评价IL-1β、IL-6、TNF-α和HE评分对微生物群组合的影响。去铁杆菌门与IL-6、IL-1β、TNF-α和HE评分呈正相关,相关系数分别为0.852(p<0.001)、0<0.852(p<0.001)、0.843(p<0.001)和0.852(p<0.001)。蓝细菌门的丰度与IL-6(r=0.523,p<0.05)和TNF-α(r=0.520,p<0.05)呈负相关。在属水平上,幽门螺杆菌与IL-6、IL-1β、TNF-α和HE评分呈正相关,相关系数分别为0.816(p<0.001)、0.776(p<0.001)、0.749(p<0.001)和0.635(p<0.01)。12B)。蛛网膜梭状芽孢杆菌与IL-1β、IL-6和TNF-α也呈正相关,相关系数分别为0.700(p<0.01)、0.515(p<0.05)和0.509(p<0.05)。而腐烂别样杆菌与IL-6和TNF-α呈负相关,相关系数分别为0.482(p<0.05)和0.517(p<0.05)。


图3.六组小鼠肠道微生物热图分析(A.门水平,B.属水平)

③PICRUSt分析

预测IA和IA+LPS组的功能基因,1343条显著差异通路,其中“全局和概述”、“碳水化合物代谢”、“氨基酸代谢”、“能量代谢”、“辅助因子和维生素代谢”、“膜运输”、“核苷酸代谢”、“翻译”、“复制修复”、“信号转导”的平均比例最高,且都是显著代谢途径(p<0.05)。


图4.PICRUSt功能预测分析

研究结论

康普茶可有效预防脓毒症初期小鼠的细胞免疫功能紊乱,并发挥免疫调节作用。此外,补充康普茶改变了肠道微生物群的多样性,促进了丁酸盐产生细菌的生长,发挥抗炎作用。

总结

通过以上两篇文章,我们可以发现,通过肠道菌群全长微生物多样性测序+生理生化指标测定+细胞因子检测+代谢组学检测等能够较为全面的阐明生物学问题。通过对多组学数据进行相关性分析进而可以得到菌群与细胞因子,菌群与代谢物之间的相关性,同时运用PacBio全长微生物多样性能够在种水平上寻找差异的物种,进一步提升biomarker的鉴定水平。正值年末,百迈客微生物系列产品促销活动火热进行中,无论是测序还是分析,价格优惠,欢迎垂询~

以上论文的测序和部分数据分析工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。如您有任何疑问,欢迎讨论区留言或者发邮件给我们(邮箱地址:tech@biomarker.com.cn)

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参考文献:

1.Zhang L, Jing J, Han L, et al. Characterization of gut microbiota, metabolism and cytokines in benzene-induced hematopoietic damage[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2021, 228: 112956.

2.Wang P, Feng Z, Sang X, et al. Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model[J]. Food & Function, 2021, 12(20): 10263-10280.

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