Pacbio基因组实验流程材料方法

1、提取方法

1.1植物组织：CTAB法

1)液氮研磨样品，分装至离心管中

2)向离心管中加入 CTAB，水浴

3)离心后向上清中加入氯仿/异戊醇（24:1），离心

4)向上清中加入异丙醇和乙酸钠溶液，离心，弃上清

5)加入 75％乙醇，离心，弃上清

6)晾干，加入 TE 溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2动物组织：SDS法

1)液氮研磨组织样，分装至离心管中

2)加入 SDS 溶液，水浴

3)加入 NaCl 溶液，静置后离心

4)向上清中加入氯仿/异戊醇（24:1）后离心

5)向上清中加入异丙醇后离心，弃上清

6)加入 75％乙醇，离心，弃上清

7)晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3动物血液：Kurabo 试剂盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，厂家：Kurabo，货号：40321300101

1.4粗体核酸纯化

试剂盒名称：QIAGEN Genomic-tip 20/G，厂家：QIAGEN，货号：10223

试剂盒名称：QIAGEN Genomic-tip 100/G，厂家：QIAGEN，货号：10243

1.5微生物样本

使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒完成核酸的提取

2、检测方法

2.1检测方法

1)浓度检测

Nanodrop：赛默飞 Thermo ，型号 NANODROP2000

Qubit：invitrogen ，型号QubitTM3Flurometer

2)完整性检测（琼脂糖凝胶电泳）

电泳仪：厂家：天能 Tanon ，型号 EPS600

电泳槽：厂家：天根生化科技（北京）有限公司，型号：HE- 120

2.2判定标准

1)总量≥6μg（单次建库）

2)浓度≥50ng/ul

3)体积≥10(ul)

4)OD260/280在1.7-2.2之间，OD260/230在1.7-2.5之间

5)AGE：size≥23K，降解条带>5K，点样孔无或有轻微污染，N/Q在0.9-2.0之间

6)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

注：特殊物种实验人员会根据经验进行判断，具体以检测报告中的判断结果为准

3、建库方法

1) DNA 打断

A.加入0.75-1.5 μg gDNA，补Elution Buffer 至100 μL，将gDNA样品稀释到终浓度为7.5 ng/μL -15 ng/μL。小心转移到g-TUBE 管中，4600rpm离心2分钟

B.重复离心，直至全部gDNA样品通过g-TUBE孔洞

C.倒置g-TUBE管，离心2分钟

D.收集打断好的gDNA样品于新的1.5 mL低吸附离心管中

2)PB纯化

A.将gDNA样品稀释到100 μL，若体积超过100 μL，则不需要稀释

B.向样品中中加入 0.45*体积的AMPure PB磁珠（室温平衡30分钟）

C.使用宽口枪头轻轻吹打15次，混匀上述样品，瞬离1秒

D.室温放置30分钟，瞬离1秒

E.转移离心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，将上清液转移到新离，备用

F.使用1.5ml 新配的80%酒精洗涤磁珠，30秒后弃掉酒精，重复一次

G.瞬离1s，将酒精弃净

H.向管中加入20 μL 1X Elution Buffer，使用宽口枪头轻轻吹打15次，进行混匀

I.10-15分钟溶解DNA，瞬离1秒

J.吸取20 μL上清液于新的1.5 mL低吸附离心管中

K.取1 μL稀释5倍，使用Qubit进行浓度测定

3)DNA修复

A.向纯化产物中分别加入以下试剂：

B.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1秒

C.向每个样品中加入14μL Reaction Mix 1

D.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀，瞬离1秒

E.孵育

4)接头连接

A.向上述产物中分别加入以下试剂

B.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1秒

C.向每个样品中加入35μL Reaction Mix 2

D.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀，瞬离1秒

E.孵育

5)PB纯化

A.向样品中中加入1*体积的SMRT bell cleanup beads（室温平衡30分钟）

B.使用宽口枪头轻轻吹打15次，混匀上述样品，瞬离1秒

C.室温放置10分钟，瞬离1秒

D.转移离心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，将上清液转移到新离，备用

E.使用1.5ml新配的80%酒精洗涤磁珠，30秒后弃掉酒精，重复一次

F.瞬离1s，将酒精弃净

G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用宽口枪头轻轻吹打15次，进行混匀

H.室温5分钟溶解DNA，瞬离1秒

I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附离心管中

J.取1μL稀释5倍，使用Qubit进行浓度测定

6)酶处理

A.向上述纯化产物中分别加入以下试剂

B.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1秒

C.孵育

7)PB磁珠片段筛选

A.向上述产物中加入3.1*体积的2.85*稀释的AMPurePB磁珠（室温平衡30分钟）

B.使用宽口枪头轻轻吹打15次，混匀上述样品，瞬离1秒

C.室温放置20分钟，瞬离1秒

D.转移离心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，将上清液转移到新离心管，备用

E.使用1.5ml新配的80%酒精洗涤磁珠，30秒后弃掉酒精，重复一次

F.瞬离1s，将酒精弃净

G.向管中加入1X Elution Buffer，使用宽口枪头轻轻吹打15次，进行混匀

H.室温10-15分钟溶解DNA，瞬离1秒

I.吸取上清液于新的1.5mL低吸附离心管中

J.取1μL稀释5倍，使用Qubit进行浓度测定。纯化后DNA样品可以在4℃保存2周，可以长期保存于-20℃，但避免反复冻融

4、测序方法

1)最终文库通过浓度（Qubit）及大小（Agilent 5400）的检测，总量需要大于Smrtlink计算值。

2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 对上机文库进行上机前的结合，使文库结合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）

3)将最终的反应产物进行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）纯化后置于Revio（Pacbio，USA）测序仪上进行测序

5、实验用试剂

 

6、实验用设备