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1、提取方法

1.1 植物组织：CTAB法

  1. 液氮研磨样品，分装至离心管中
  2. 向离心管中加入 CTAB，水浴
  3. 离心后向上清中加入氯仿/异戊醇（24:1），离心
  4. 向上清中加入异丙醇和乙酸钠溶液，离心，弃上清
  5. 加入 75％乙醇，离心，弃上清
  6. 晾干，加入 TE  溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2 动物组织：SDS法

  1. 液氮研磨组织样，分装至离心管中
  2. 加入 SDS 溶液，水浴
  3. 加入 NaCl 溶液，静置后离心
  4. 向上清中加入氯仿/异戊醇（24:1）后离心
  5. 向上清中加入异丙醇后离心，弃上清
  6. 加入 75％乙醇，离心，弃上清
  7. 晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3 动物血液：Kurabo 试剂盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，厂家：Kurabo，货号：40321300101

1.4 粗体核酸纯化

  • 试剂盒名称：QIAGEN Genomic-tip 20/G，厂家：QIAGEN，货号：10223
  • 试剂盒名称：QIAGEN Genomic-tip 100/G，厂家：QIAGEN，货号：10243

1.5 微生物样本

使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒完成核酸的提取

2、检测方法

2.1检测方法

  • 浓度检测

Nanodrop：赛默飞 Thermo ，型号 NANODROP2000

Qubit：厂家YEASEN, 型号CAT 12642-A ，试剂1XdsDNA HS Assay kit for Qubit

  • 完整性检测（琼脂糖凝胶电泳）

电泳仪：厂家：Monad ，型号 Universal – P

电泳槽：厂家：Tanon，型号：HE- 120

2.2 判定标准

  • 总量≥6μg（单次建库）
  • 浓度≥50ng/ul
  • 体积≥10(ul)
  • OD260/280在7-2.2之间，OD260/230在1.8-2.5之间
  • AGE：size≥23K，降解条带>5K，点样孔无或有轻微污染，N/Q在8-2.5之间
  • 样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

注：特殊物种实验人员会根据经验进行判断，具体以检测报告中的判断结果为准

3、建库方法

DNA 打断

  1. 加入75-1.5 μg gDNA，补Elution Buffer 至100 μL，将gDNA样品稀释到终浓度为7.5 ng/μL -15 ng/μL。小心转移到g-TUBE 管中，4600rpm离心2分钟
  2. 重复离心，直至全部gDNA样品通过g-TUBE孔洞
  3. 倒置g-TUBE管，离心2分钟
  4. 收集打断好的gDNA样品于新的5 mL低吸附离心管中

PB纯化

  1. 将gDNA样品稀释到100 μL，若体积超过100 μL，则不需要稀释
  2. 向样品中中加入45*体积的AMPure PB磁珠（室温平衡30分钟）
  3. 使用宽口枪头轻轻吹打15次，混匀上述样品，瞬离1秒
  4. 室温放置30分钟，瞬离1秒
  5. 转移离心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，将上清液转移到新离，备用
  6. 使用5ml 新配的80%酒精洗涤磁珠，30秒后弃掉酒精，重复一次
  7. 瞬离1s，将酒精弃净
  8. 向管中加入20 μL 1X Elution Buffer，使用宽口枪头轻轻吹打15次，进行混匀
  9. 10-15分钟溶解DNA，瞬离1秒
  10. 吸取20 μL上清液于新的5 mL低吸附离心管中
  11. 取1 μL稀释5倍，使用Qubit进行浓度测定

DNA修复

  • 向纯化产物中分别加入以下试剂
试剂 体积（μL）
Repair buffer 8
End repair Mix 4
DNA repair mix 2
总体积（Reaction Mix 1） 14
  • 使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1秒
  • 向每个样品中加入14μL Reaction Mix 1
  • 使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀，瞬离1秒
  • 孵育
温度 时间（min）
37℃ 30
65℃ 5
4℃ Hold

接头连接

  • 向上述产物中分别加入以下试剂
试剂 体积（μL）
SMRTbell adapter 4
Ligation mix 30
Ligation enhancer 1
总体积（Reaction Mix 2） 35
  • 使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1秒
  • 向每个样品中加入35μL Reaction Mix 2
  • 使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀，瞬离1秒
  • 孵育
温度 时间（min）
20℃ 30
4℃ Hold

PB纯化

  • 向样品中中加入1*体积的SMRT bell cleanup beads（室温平衡30分钟）
  • 使用宽口枪头轻轻吹打15次，混匀上述样品，瞬离1秒
  • 室温放置10分钟，瞬离1秒
  • 转移离心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，将上清液转移到新离，备用
  • 使用5ml新配的80%酒精洗涤磁珠，30秒后弃掉酒精，重复一次
  • 瞬离1s，将酒精弃净
  • 向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用宽口枪头轻轻吹打15次，进行混匀
  • 室温5分钟溶解DNA，瞬离1秒
  • 吸取40μL上清液于新的5mL低吸附离心管中
  • 取1μL稀释5倍，使用Qubit进行浓度测定

酶处理

  • 向上述纯化产物中分别加入以下试剂
试剂 体积（μL）
Nuclease buffer 5
Nuclease mix 5
总体积（Reaction Mix 3） 10
  • 使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1秒
  • 孵育
温度 时间（min）
37℃ 15
4℃ Hold

PB磁珠片段筛选

  1. 向上述产物中加入1*体积的2.85*稀释的AMPurePB磁珠（室温平衡30分钟）
  2. 使用宽口枪头轻轻吹打15次，混匀上述样品，瞬离1秒
  3. 室温放置20分钟，瞬离1秒
  4. 转移离心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，将上清液转移到新离心管，备用
  5. 使用5ml新配的80%酒精洗涤磁珠，30秒后弃掉酒精，重复一次
  6. 瞬离1s，将酒精弃净
  7. 向管中加入1X Elution Buffer，使用宽口枪头轻轻吹打15次，进行混匀
  8. 室温10-15分钟溶解DNA，瞬离1秒
  9. 吸取上清液于新的5mL低吸附离心管中
  10. 取1μL稀释5倍，使用Qubit进行浓度测定。纯化后DNA样品可以在4℃保存2周，可以长期保存于-20℃，但避免反复冻融

4、测序方法

  • 最终文库通过浓度（Qubit）及大小（Agilent 5400）的检测，总量需要大于Smrtlink计算值。
  • 使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 对上机文库进行上机前的结合，使文库结合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）
  • 将最终的反应产物进行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）纯化后置于Revio（Pacbio，USA）测序仪上进行测序

5、实验用试剂

物料名称 厂家 存货代码 规格
g-TUBE Covaris g-TUBE 10个/盒
SMRTbell Prep Kit 3.0 PACBIO 102-182-700 24次/盒
Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer 英潍捷基 Q32854 500次/盒
AMPure PB (5ml)(纯化磁珠) PACBIO 100-265-900 5ml/瓶
SMRTbell cleanup Beads PACBIO 102-158-300 10000ul/瓶
REVIO SPRQ POLYMERASE KIT PACBIO 103-496-900 24次/盒
REVIO SPRQ SEQUENCING PLATE PACBIO 103-504-900 4次/盒
REVIO SMRT CELL TRAY PACBIO 102-202-200 4张/盒

6、实验用设备

仪器名称 生产厂家 型号
瞬时离心机 天根生化科技（北京）有限公司 OSE-MC8
﹣20℃度冰箱 青岛海尔特种电冰柜有限公司 BC/BD-629HK
4°C 冰箱 海尔 HYC-360
涡旋振荡器 SCIENTIFICINDUSTRIES.INC vortex-2G560E
基因扩增仪 Appliedbiosystems veriti96well9902
恒温金属浴 Eppendorf ThermoMixer F1.5
磁力架 赛默飞世尔 DynaMag96Side skirted
测序仪 Pacbio Revio

 

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