广靶代谢组、TMT标记定量蛋白组结合PRM靶向验证，解读灵芝发酵茶生物碱的调控变化机制

近日，西南大学联合贵州省茶叶研究所在著名期刊Food Research International上发表了一篇题为“Metabolomic and proteomic analysis reveals the metabolic changes of alkaloids in Ganoderma lucidum fermented tea”的研究。

该研究采用广靶代谢组、TMT标记定量蛋白组结合PRM靶向验证的技术方案，建立“代谢-蛋白”关联网络，填补现有研究缺口，为粗老茶叶高值化利用及灵芝发酵调控茶叶品质提供理论支撑。

研究背景

当前茶叶资源存在浪费问题，大量粗老茶叶因品质不佳被废弃，亟需高值化利用技术。外源接种灵芝发酵可有效提升茶叶风味与品质。咖啡因等生物碱是茶叶苦味核心，其代谢直接决定口感，但现有研究仅关注单一代谢物，未从蛋白-代谢层面解析灵芝调控生物碱的机制，缺乏分子证据。

材料方法

实验材料

原料：黔湄601绿茶（粗老叶）

菌种：灵芝“梵芝1号”

样品：发酵0d/5d/10d/15d/20d+干燥成品GLFT

分组设置

代谢组：UPLC-QTRAP-MS/MS，广靶检测次生代谢物

蛋白组：TMT标记定量，鉴定差异表达蛋白

靶向验证：PRM平行反应监测，验证关键蛋白

数据分析：PCA、差异筛选、KEGG/GO富集、相关性分析

感官评价：5人专业评审团，对茶叶外形、汤色、香气、滋味等评分

研究结果

灵芝发酵茶制备流程

流程：菌株驯化→绿茶灭菌→接种→25℃发酵20d→70℃干燥→GLFT成品

关键：灵芝经茶汁梯度驯化，适配茶叶环境，发酵更稳定。

代谢物整体变化特征

共鉴定2155种次生代谢物，生物碱占10.4%。

PCA显示：未发酵样（F0d）与发酵样显著分离，不同发酵阶段样本聚类清晰，数据可靠。

差异代谢物：共筛选832种；发酵期以下调为主，干燥期大量上调积累。

生物碱及关联代谢物动态

筛选11种关键差异生物碱：咖啡因、茶碱、可可碱、甜菜碱、N-甲基烟酸等。

变化规律：

嘌呤类（咖啡因/茶碱/可可碱）：发酵期逐渐积累，15–20d达峰，干燥后略降。

甜菜碱：持续下降，GLFT最低。

N-乙基金雀花碱/千里光宁：发酵期稳定，干燥后骤升。

KEGG富集：主要富集在咖啡因代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路。

蛋白组整体变化

共鉴定3031种蛋白，筛选1207个差异蛋白。

阶段特征：

0–5d：差异蛋白最多，灵芝作用最剧烈，蛋白以合成为主。

5–10d：差异蛋白最少，过程平稳。

15–20d、干燥期：蛋白以下调降解为主。

功能注释：GO/KEGG/COG三库共注释877个核心蛋白，构成发酵调控网络。

生物碱-关键蛋白关联

筛选24个生物碱代谢核心差异蛋白。

关键蛋白：

UOX（尿酸氧化酶）：调控咖啡因等嘌呤生物碱代谢。

SHMT（丝氨酸羟甲基转移酶）：通过甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸通路间接调控生物碱。

甜菜碱、N-甲基烟酸相关蛋白：集中在氨基酸代谢、氧化还原、氮代谢通路。

相关性：多数蛋白与对应生物碱显著正相关，部分呈负相关。

PRM靶向验证

对30个关键蛋白靶向定量，18个显著差异。

核心蛋白：

VOC结构域蛋白、叶绿体核糖体循环因子：发酵初期极显著上调，参与氧化应激响应。

SHMT（A0A7J7H649、A0A7J7I2J8）：变化最显著，证实其在氨基酸-生物碱代谢中的核心作用。

结论：PRM结果与TMT蛋白组高度一致，数据可靠。

生物碱代谢通路全景

核心枢纽：乙醛酸代谢连接咖啡因降解、甜菜碱转化、精胺合成。

关键流向：

咖啡因→1,3,7-三甲基尿酸→乙醛酸循环

甜菜碱→甘氨酸→氨基酸/生物碱前体

腐胺→N-甲基烟酸→吡啶类生物碱

机制：灵芝通过调控氨基酸代谢，间接重塑生物碱谱，降低苦涩、优化风味。

研究总结

品质提升：灵芝发酵让粗老绿茶感官评分从79.8升至91.1，汤色红亮、滋味甜醇、无苦涩。

代谢规律：发酵重塑生物碱组成，嘌呤生物碱适度积累，甜菜碱持续下降，干燥驱动特征物富集。

核心机制：24个关键蛋白（尤其是SHMT、UOX）通过氨基酸代谢通路，间接调控生物碱转化。

应用价值：为灵芝发酵茶品质精准调控、粗老茶叶高值化提供理论与分子靶点。

科学创新：首次建立“灵芝发酵-蛋白调控-生物碱代谢”的关联网络，填补真菌-茶叶互作机制空白。