Pacbio Revio平台实验流程材料方法

 

1、提取方法

1)植物叶片：（天根 DP441（厂家：天根，型号：DP441）

2)植物根、茎、种子：艾德莱 RN40（厂家：艾德莱，型号：RN40））试剂盒

3)动物常规组织：TRIzol

4)皮肤、毛发：凯捷 217044（厂家：凯捷。型号：217004）

5)全血PAX管送样：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（厂家：GENENODE。型号：2145A）试剂盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Nanodrop2000 （厂家：赛默飞，型号 ：Nanodrop2000）对于提取的核酸进行浓度纯度检测，并使用 LabChip GX（厂家：铂金埃尔默，型号：LabChip GX Touch HT）对完整性进行检测

2.2判定标准

1)总量≥1（ug），满足 2 次建库

2)浓度≥20（ng/ul）

3)体积≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之间，OD260/230 在 0.5-2.5 之间，260nm 吸收峰显示正常

5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同时若GX检测6.0-6.4的需结合基线判断，28S/18S≥1 且基线无上抬或轻微上抬

6)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

3、建库方法

3.1建库流程

1) 全长cDNA的合成

A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下试剂

B.轻弹混匀，瞬时离心，置于PCR仪上

C.70℃反应 5 min ，20℃ hold（80℃热盖），立即进行下步反应

D.在上步反应期间，配制如下Mix

E.轻弹混匀，瞬时离心

F.取 cDNA 反应产物 9 μL 中加入 10 μL 上述 Mix

G.轻弹混匀，瞬时离心

H.42℃反应 45 min ，20℃ hold（52℃热盖），立即进行下步反应

I.向反应完的产物中加入 2 μL Iso-Seq template switch oligo ，总体积达到 21 μL

J.轻弹混匀，瞬时离心

K.42℃反应 15 min ，4℃ hold（52℃热盖）

2)磁珠纯化

A.将上步反应产物（21μL），移入新的1.5mL低吸离心管中，加入29μLElutionBuffer

B.向1.5mL离心管中加入1.3×（65μL）体积的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室温平衡30min），充分轻弹混匀

C.室温孵育10min

D.瞬时离心，将样品置于磁力架上至上清液澄清（约2min）

E.弃上清，保持离心管于磁力架上，沿对壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），静置30s

F.弃上清，重复漂洗一次

G.瞬时离心，用10μl枪头弃尽上清，室温干燥1min

H.向离心管中加入21μL的ElutionBuffer，轻弹混匀，室温孵育5min

I.置于磁力架上2min，转移上清液至新200μL离心管

3)cDNA扩增

A.取一新的1.5mL 离心管，加入如下试剂

Reagent Volume（μL）

B.向纯化产物中加入27μl上述mix

C.加入2μlIso-SeqprimerBarcode，总体积达到50μl

D.充分轻弹混匀，瞬时离心

E.按照下面反应程序反应

 

4)磁珠纯化

A.将上步PCR产物分别导入一新的1.5mL低吸离心管中

B.向50μL体积1.5mL离心管中加入0.9X（45μL）体积的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混匀，瞬时离心

C.室温孵育10min

D.瞬时离心，将样品置于磁力架上至上清液澄清（约2min）

E.弃上清，保持离心管于磁力架上，沿对壁加入200μl新配置的80%乙醇，静置30s

F.弃上清，重复漂洗一次

G.弃尽上清，室温干燥1min

H.向离心管分别加入24μL的Elution Buffer，轻弹混匀，室温孵育5min

I.置于磁力架上2min，转移上清液至新1.5mL离心管

J.取2μL稀释液进行Qubit定量，确定PCR产物总

5)混样

A.根据 Qubit 检测结果、数据需求量进行混样，混样总量达到 55ng ，置于冰上

B.轻弹混匀，瞬时离心

6)kinnex PCR

A.分别加入以下试剂

B.分 22.5 μL 的 Mix 产物加入到 8 连排管中

C.每管中加入2.5μL Kinnex primer mix A-HQ

D.轻弹混匀，瞬时离心

E.按照下面反应程序反应

7)磁珠纯化

A.将上步PCR产物分别导入一新的1.5mL低吸离心管中，总体积184μL

B.向1.5mL离心管中加入1.05X（193μL）体积的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混匀，瞬时离心

C.室温孵育10min

D.瞬时离心，将样品置于磁力架上至上清液澄清（约2min）

E.弃上清，保持离心管于磁力架上，沿对壁加入200μl的新配置的80%乙醇，静置30s

F.弃上清，重复漂洗一次

G.弃尽上清，室温干燥1min

H.向离心管分别加入24μL的Elution Buffer，轻弹混匀，室温孵育5min

I.置于磁力架上2min，转移上清液至新1.5mL离心管

J.取2μL稀释液进行Qubit定量，确定PCR产物总量

8)串联

A.分别加入以下试剂

B.配置以下mix

C.向41μL反应产物中加入17μL的mix，轻弹混匀，瞬时离心

D.45℃反应60min，4℃hold（52℃热盖）

E.加入2μLDNArepairmix，轻弹混匀，瞬时离心

F.45℃反应30min，4℃hold（60℃热盖）

9)磁珠纯化

A.将上步反应产物移入新的1.5mL低吸离心管中，总体积60μL

B.向1.5mL离心管中加入1×（60μL）体积的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室温平衡30min），充分轻弹混匀

C.室温孵育10min

D.瞬时离心，将样品置于磁力架上至上清液澄清（约2min）

E.弃上清，保持离心管于磁力架上，沿对壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），静置30s

F.弃上清，重复漂洗一次

G.瞬时离心，用10μl枪头弃尽上清，室温干燥1min

H.向离心管中加入40μL的ElutionBuffer，轻弹混匀，室温孵育5min

I.置于磁力架上2min，转移上清液至新200μL离心管

J.使用Qubit检测浓度

10)酶处理

A.向上述纯化产物中分别加入以下试剂

B.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1s

C.孵育

11)PB磁珠片段筛选

A.向上述产物中加入3.1*体积的 2.85*稀释的AMPure PB磁珠（室温平衡30分钟）

B.使用宽口枪头轻轻吹打15次，混匀上述样品，瞬离1s

C.室温放置20min，瞬离1s

D.转移离心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，将上清液转移到新离心管，备用

E.使用1.5ml 新配的80%酒精洗涤磁珠，30秒后弃掉酒精，重复一次

F.瞬离1s，将酒精弃净

G.向管中加入 1X Elution Buffer，使用宽口枪头轻轻吹打15次，进行混匀

H.室温10-15min溶解DNA，瞬离1s

I.吸取上清液于新的1.5 mL低吸附离心管中

J.取1 μL稀释5倍，使用Qubit进行浓度测定。纯化后DNA样品可以在4℃保存2周，可以长期保存于-20℃，但避免反复冻融

4、测序方法

1)最终文库通过浓度（Qubit）检测，总量需要大于Smrtlink

2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 对上机文库进行上机前的结合，使文库结合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）

3)将最终的反应产物进行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）纯化后置于Revio（Pacbio，USA）测序仪上进行测序

5、实验试剂

6、实验设备