Hi-C实验步骤流程及材料方法

 

1、固定

1.1植物组织

1)配置固定Buffer

2)实验步骤

A.收集4g新鲜、干净、长势完全正常的幼嫩组织样品（如有污物，需要提前处理干净），并至于冰上

B.每2g收集的新鲜组织使用剪刀剪成碎片，各放置于一个50ml的离心管中

C.往50ml离心管中添加提前预冷的35ml固定Buffer和2ml 36%的甲醛溶液，室温下，旋转杂交炉或者其它可旋转设备中旋转反应90min

D.加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脱色摇床100r混匀5min，终止交联

E.滤掉固定液，用无菌ddH2O清洗几次（至无泡沫）

F.吸干样品表面水分，将样品至于液氮中研磨

G.每4g研磨后的样品存于一个50ml离心管中，并将离心管至于自封袋中，在-80℃保存备用

1.2动物组织

1)取1g处理干净的组织样，将样本置于液氮中充分研磨

2)将研磨后的组织置于预冷的50ml离心管中，加入30ml 1xPBS充分混匀

3)使用Falcon细胞网过筛2次（100um+40um），除去杂质，收集滤液，加入35ul PMSF和适量的1x PBS，补至35ml

4)加入2ml 37%甲醛，室温条件下置于旋转摇床上反应60min

5)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脱色摇床100r混匀5min，终止交联

6)3000g 4℃离心5min，弃掉上清保留沉淀

1.3速冻植物组织

1)取50mg速冻组织样于2ml国产离心管中，加入钢珠，使用打碎仪液氮充分研磨

2)在研磨后的组织中加入1ml的NIBuffer工作液1中，震荡混匀之后过100um的滤网，补充适量的NIBuffer工作液1至全部过滤完成，使用50ml离心管收集滤液（冰上操作）

3)在滤液中加入巯基乙醇、PMSF和37%甲醛溶液，室温杂交反应一定时间

4)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脱色摇床100r混匀5min，终止交联

5)3000g 4℃离心5min，弃掉上清保留沉淀

1.4细胞

1)用1ml 1x PBS重悬细胞样品（要求客户自己固定完成），转移至1.5ml离心管中

2)4℃ 650g离心10min，弃上清

3)将1ml Lysis Buffe 工作液加入到装有样品沉淀的离心管中，充分混匀，重悬样品

4)离心管放在冰上，并置于摇床上100r，混匀15min

5)650g，4℃，离心10min，弃掉上清，保留沉淀

1.5血液

1)取1ml新鲜全血至50ml离心管中，加入3ml红细胞裂解液，轻轻混匀

2)冰上放置15min（每5min颠倒混匀一次）

3)4℃450g离心10min，弃掉上清

4)加入2ml的红细胞裂解液，轻轻混匀白细胞

5)4℃450g离心10min，弃掉上清

6)加入45ml 1XPBS，重悬沉淀

7)加入2.5ml37%甲醛，充分混匀，室温旋转杂交60min

8)加入2.5ml 2M的甘氨酸，使用脱色摇床100r混匀5min，终止交联

9)650g 4℃离心5min，弃掉上清保留沉淀

2、细胞裂解和酶切

1)配置适当裂解体系冰上裂解细胞

2)用梯度密度离心法从裂解的细胞中提取细胞核

3)用限制性内切酶酶切细胞核

3、末端标记和平端连接

1)配置适当标记体系对末端标记生物素

2)将补平的末端用T4 DNA连接酶进行平末端连接

4、DNA纯化（解交联）

1)配置解交联反应试剂

2)将解交联反应试剂加入样品中，充分混匀，金属浴55℃，900rpm反应30min

3)加入适量的NaCl溶液，充分混匀，金属浴65℃，900rpm反应90min

4)反应结束后5000rpm室温离心3min，取上清液至新的离心管中

5)加入XP磁珠，混匀瞬时离心，室温孵育10min

6)将样品放置于磁力架上，直到液体澄清

7)小心弃掉上清液，加入200ul新鲜配置的80%乙醇，静置20s，弃掉上清液

8)重复步骤7

9)取下离心管，瞬时离心，吸干净残留的液体

10)室温静置3min，待磁珠表面呈现磨砂状

11)将离心管从磁力架上取下来，加入85ul EB，充分混匀磁珠，室温静置5min

12)将离心管置于磁力架上，待到液体澄清，将上清液转移至新的离心管中

5、Hi-C文库制备（采用Mate-pair Kit）

5.1文库制备流程

取1ug DNA样品（体积最大取41ul）除去末端标记但未连接的DNA，金属浴反应，反应结束后用于后续的实验

1)Ampure XP磁珠纯化DNA

A.取90ul的XP磁珠至上述反应结束的离心管中，用移液器吹吸混匀，瞬离后室温静置5min

B.将样品置于磁力架上，待液体澄清后，小心弃掉上清液

C.加入200ul新鲜配置的80%乙醇，室温静置20s，小心移除上清液

D.重复步骤C

E.取下样品管，瞬时离心，吸干残留的液体

F.将离心管重新置于磁力架上，室温静置2-4min，磁珠表面无明显水珠即可

G.从磁力架上取下离心管，加入18ul NF水，混匀重悬磁珠，室温孵育5min

H.将样品置于磁力架上，待液体澄清后，小心吸取上清液至新的离心管中备用

2)片段化、末端修复及加A

A.取0.5ug（最大体积17ul）纯化后的DNA

B.加入配置好的反应试剂，混匀后瞬离

C.置于PCR仪中按照设置好的程序进行反应

3)接头连接及纯化

A.在反应结束后的样品中加入接头连接需要的试剂

B.吹吸混匀，瞬离后置于PCR仪上进行反应

C.在反应结束的样品中加入50ul的XP磁珠，混匀瞬离，室温反应5min

D.将样品置于磁力架上，待液体澄清后，小心弃掉上清液

E.加入200ul新鲜配置的80%乙醇，室温静置20s，小心移除上清液

F.重复步骤E

G.取下样品管，瞬时离心，吸干残留的液体

H.将离心管重新置于磁力架上，室温静置2-4min，磁珠表面无明显水珠即可

I.从磁力架上取下离心管，加入28ul NF水，混匀重悬磁珠，室温孵育5min

J.直到液体澄清后小心转移上清液至新的离心管中

4)目标捕获

A.使用TWB和BB试剂重悬C1磁珠

B.取10ul重悬后的使用BB溶解的磁珠，加入纯化后的样品中

C.混匀后置于旋转的混匀仪反应15min

5)PCR文库扩增及片段筛选

A.将样品置于磁力架上，待液体澄清之后弃掉上清液

B.分别使用200ul的BB试剂和NEB试剂重悬磁珠

C.弃掉上清，瞬离，离心管置于磁力架上，用枪头吸干残留的液体

D.室温静置2-4min，至磁珠表面无明显水珠

E.取下离心管，加入10ul的NF水，重悬磁珠，用于PCR扩增

F.配置好PCR扩增试剂后，混匀，连同磁珠一起置于PCR仪上进行扩增

G.PCR结束后，将样品置于磁力架上，待液体澄清后吸取上清液至新的离心管中

H.补水至50ul，并加入30ul的XP磁珠，吹吸混匀室温静置5min

I.置于磁力架上，待液体澄清后，弃掉上清

J.加入200ul新鲜配置的80%乙醇，室温静置20s，小心移除上清液

K.重复步骤J

L.取下样品管，瞬时离心，吸干残留的液体

M.将离心管重新置于磁力架上，室温静置2-4min，磁珠表面无明显水珠即可

N.取下样品管，加入30ul的Elution Buffer，混匀，瞬离，室温静置5min

O.置于磁力架上，待液体澄清后吸取上清液进行文库质检

5.2文库质检

1)质检方法：文库通过 Qsep-400 进行片段质检， 使用酶标仪进行文库浓度的定量

2)库检标准：库检片段呈正态分布状，300bp起峰，800bp落峰；片段无前后拖尾、无接头、无杂峰；浓度大于1ng/ul

5.3建库用试剂耗材

1)文库构建试剂盒：VAHTSTM Fg DNA Library Prep Kit  for I11umina 货号ND617-02

2)产物纯化磁珠：Agencourt® AMPure® XP，货号A63882

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

5.4建库用设备

 

6、测序方法

测序设备：NovaSeq X plus

测序试剂盒：NovaSeqTMX  Series25B Rgt Kit