【项目文章】miRNA研究解析苹果嫩枝弯曲促进花芽形成的机制

miRNA参与调控苹果嫩枝弯曲促进花芽形成的机制
Shoot bending promotes flower bud formation by miRNA-mediated regulation in apple (Malus domestica Borkh.)
Plant Biotechnology Journal，2015

 

实验结果

开花诱导在苹果树生命周期中发挥非常重要的作用，但是年轻的苹果树往往容易产生低质量的数量少的花芽。嫩枝弯曲可以促进产生较多的花芽，因此嫩枝弯曲成为苹果树一个非常重要的栽培性状。树嫩枝弯曲会产生一种新的长距离信号，从而改变树的生长和发育。但是，响应嫩枝弯曲发生的花芽生长和开花诱导的分子调控机制并不清楚，尤其是miRNA是否在其调控中发挥作用以及具体的机制如何。本研究关注在花芽发育、开花诱导和发育、响应嫩枝弯曲过程中miRNA的潜在作用。

 

研究目的

解析苹果树响应嫩枝弯曲时，植物激素和miRNA协同调控花芽生长和开花诱导的分子机制，有助于解决年轻苹果树低质量花芽的问题。

 

材料方法

1.实验材料：
生长六年大小的富士苹果树，分两组进行嫩枝弯曲（110度）、对照处理（垂直嫩枝），分别在开花诱导的初期（early stage，ES）、中期（Middle stage，MS）和晚期（Later stage，LS）取花芽，分别提取RNA进行小RNA测序，6个花芽组织RNA混样进行降解组测序。
2.测序方法：
小RNA seq，Biomarker Illunima Hiseq 2000 platform

 

技术路线

 

实验结果

1. 富士苹果树在开花诱导时期响应嫩枝弯曲后的花芽生长
首先，研究富士苹果树在开花诱导时期，嫩枝弯曲处理后花芽生长情况。无论是对照还是嫩枝弯曲处理，从发育早期（ES）到晚期（LS），花芽的长度、宽度、干重都增加了。但是，嫩枝弯曲明显增加了花芽的大小。此外，通过检测花芽生长速率发现，花芽大小变化主要发生在花芽诱导的早期，即ES到MS时期；而且，在嫩枝弯曲处理下花芽生长速率明显增加了。实验结果还显示，嫩枝处理组比对照组的开花速率明显增大了。

2. 开花诱导时期花芽中激素含量的变化。
分别在开花诱导的三个时间点（ES, MS, LS），对嫩枝弯曲处理组和对照组的花芽中激素（生长素，AUX；脱落酸，ABA；细胞分裂素，CK；赤霉素，GA）含量进行检测。分析了在嫩枝弯曲组合对照组，开花诱导过程中各种激素含量的变化。

3. 小RNA和降解组文库构建和测序。
为了研究嫩枝处理和对照组在ES、MS和LS时期小RNA的情况，构建了6个miRNA文库（CES, CMS, CLS, BES, BMS, BLS）并用Illunima Hiseq 2000进行了测序。总共获得了14 095 388, 14 106 904, 15 242 433, 13 259 311, 15 969 504 和13 523 103 raw reads。此外，对这六个组织提取的总RNA构建了降解组文库并进行了测序，总共获得了30 762 927 (93.08%) clean reads。分别对文库进行了插入片段大小分布的评估，对sRNA的长度进行了统计分析。

4. 已知miRNA的鉴定和表达模式分析。
为了鉴定苹果中已知的miRNA，用BLASTN将这六个花芽的sRNAs比对到miRBase 18.0 和植物miRNA数据库中。总共获得了属于41个miRNA家族的195个已知的miRNA。然后对已知miRNA的表达量进行了分析。

Fig1. 差异表达已知miRNA维恩图

对同一处理不同发育时期样品间（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）筛选了差异表达miRNA并绘制了维恩图。结果显示，其中42个miRNA下调表达，20个miRNA上调表达。对不同处理相同发育时期样品间（BES vs CES, BMS vs CMS and BLS vs CLS）筛选到124个差异表达miRNA，相对对照组，嫩枝弯曲处理组中68个下调表达，27个上调表达。

 

5. 新miRNA的鉴定和表达模式分析。
用栽培种苹果（Malus domestica Borkh）作为参考基因组来预测潜在的新miRNA，共鉴定到137个新miRNA。对同一处理不同发育时期样品间（CMS vs CES, CLS vs CMS, CLS vs CES, BMS vs BES, BLS vs BMS and BLS vs BES）新miRNA进行差异表达分析并绘制了维恩图。结果显示，其中34个新miRNA随着发育时期上调表达，24个新miRNA在嫩枝弯曲处理组表达高于对照组，23个新miRNA在对照组表达明显高于嫩枝弯曲处理组。

对嫩枝弯曲处理组和对照组间的31个差异表达新miRNA进行表达层次聚类分析。结果显示，根据表达模式可分为5个亚簇。其中Cluster 1中的6个新miRNA在嫩枝弯曲组表达量均高于对照组。Cluster 5中的新miRNA表达模式则与Cluster 1中相反。其他三簇中的19个新miRNA，无论在对照组还是嫩枝弯曲处理组，展现出较低的表达水平。

Fig2. 差异表达新miRNA聚类热图

6. 已知和新miRNA的靶基因分析。
为了研究鉴定的已知和新miRNA参与的生物学过程，以及分析嫩枝弯曲调控开花诱导的分子机制，通过降解组来鉴定miRNA的靶基因。上文的分析显示，在对照组和嫩枝弯曲组之间筛选到了41个家族195个已知miRNA。对这些已知miRNA以及它们目标切割位点的具体分布信息进行了分析。同时，鉴定了31个差异表达新miRNA的40个靶标。

新miRNA调控的靶基因包括一些转录因子和调控蛋白。如，新m1736-3p的靶基因为编码一个myb-like的HTH转录因子家族蛋白（DUO1）。一些新miRNA调控的靶基因与植物激素相关，如新m1791-5p调控的靶基因为参与CK信号转导途径的细胞分裂素响应因子CRF4。此外，一些新miRNA的靶基因参与糖信号转导和代谢，如新miR1316-5p调控靶基因BGAL3。

 

7. 定量RT-PCR鉴定与AUC、ABA、控制开花相关的差异表达miRNA和靶基因
为了验证miRNA测序结果的准确性，以及分析在不同发育时期（ES-MS-LS）miRNA和靶基因的表达水平，我们检测了在响应嫩枝弯曲时与IAA、ABA、控制开花相关的miRNA和靶基因的表达模式。结果显示，与IAA、ABA信号转导相关的miRNA和靶基因可能参与调控响应嫩枝弯曲时苹果花芽的形成。

 

创新点

1.苹果树嫩枝弯曲可以促进产生较多的花芽，嫩枝弯曲是苹果树一个非常重要的栽培性状，研究解析苹果树响应嫩枝弯曲的分子机制，有助于解决年轻苹果树低质量花芽的问题。
2.结合降解组的数据来分析鉴定miRNA的靶基因，更具有说服力。
3.分析了嫩枝弯曲诱导开花过程中激素含量的变化，并集合miRNA测序数据针对性地分析了激素相关基因的调控作用，深入解析了分子机制。
4.大量qRT-PCR实验对miRNA和降解组测序数据的验证。

 

参考文献

[1] Libo Xing, Dong Zhang, Caiping Zhao, Youmei Li, Juanjuan Ma, Na An and Mingyu Han, (2015) Shoot bending promotes flower bud formation by miRNA-mediated regulation in apple (Malus domestica Borkh.) Plant Biotechnology Journal, pp. 749–770.