PILNCR1-miR399在玉米低磷胁迫下发挥重要作用

英文名称：The PILNCR1-miR399 regulatory module is important for  low-phosphate tolerance in maize

中文名称：PILNCR1-miR399在玉米低磷胁迫下发挥重要作用

发表期刊：Plant Physiology

影响因子：5.949

发表单位：中国农业科学院作科所李文学课题组

材料和方法：磷高效玉米CCM454和磷低效玉米31778用250uMPO43-或5uMPO43-进行处理达到磷缺乏或充足条件，处理2天和8天的根和地上部分做链特异性建库

实验方法：玉米稳转、烟草和玉米原生质体瞬转、qPCR、NorthernBlot、原位杂交、5，RACE等

摘要：拟南芥中microRNA399（miR399）/PHOSPHATE2（PHO2）途径介导的缺磷（P）适应性响应调控已得到较为充分研究，但玉米中的相关研究则少之又少。该研究发现，在磷酸盐（Pi）缺乏条件下，玉米miR399转录本被强烈诱导。过表达MIR399b的转基因玉米在其芽中积累了过量的P，并且具有典型的Pi毒性表型。研究人员用额外的1165bp的5’非翻译区重新注释了ZmPHO2。miR399介导的ZmPHO2转录后抑制主要出现在磷高效株系中。采用链特异性RNA建库方法鉴定出缺Pi诱导的长链非编码RNA1（PILNCR1）。在本氏烟和玉米叶原生质体中瞬时表达测定结果表明，PILNCR1抑制ZmmiR399介导的ZmPHO2切割。磷低效株系中PILNCR1的丰度显著高于磷高效株系，这与ZmmiR399转录本的丰度一致。该研究结果表明，PILNCR1和miR399之间的相互作用在玉米耐低磷方面具有重要作用。

研究背景

尽管土壤中总的磷含量很高，但由于无机磷酸盐的移动性差、溶解性低，导致土壤中能够被植物直接吸收利用的有效磷浓度很低，使植物处于一种低磷胁迫的亚健康状态。磷的有效性已经成为限制作物生产的主要环境因素之一。植物在长期的进化过程中形成了一系列适应低磷胁迫的机制，以充分利用自身特性来提高抗逆能力。不同玉米自交系对低磷胁迫的响应不同，解析磷高效和磷低效玉米品种适应低磷胁迫分子机制的差异，有助于筛选和培育磷高效玉米品种。miR399-PHO2调控通路参与植物适应低磷胁迫分子机制在拟南芥和水稻中研究的比较清楚，而玉米中还没有报道。

该研究揭示了PILNCR1-miR399互作及miR399-PHO2调控通路在不同磷利用效率玉米自交系中具有不同的作用方式，这对于培育磷高效玉米品种具有重要意义。

研究结果

1、Pi缺乏时ZmmiR399上调

PHO2在拟南芥、水稻和大麦中已经被证实是miR399的靶标，但是在玉米中预测ZmmiR399的靶标不包含PHO2和类PHO2基因，于是我们去调查miR99在玉米中的生物学功能。首先，我们调查了在磷充足（250uMPO43-）和缺乏（5uMPO43-）水培溶液中ZmmiR399的响应。在磷酸盐缺乏处理的第八天出现了表型差异，在P缺乏的玉米上表现出典型的P缺乏表型，在老叶上有黄酮类物质的积累。

为了测定在P缺乏时ZmmiR399的表达，我们执行了一个随Pi缺乏处理时间的增长，ZmmiR399在玉米根和地上部分表达情况的检测，如图1A。在Pi胁迫下，ZmmiR399的表达水平在玉米的根和地上部分都有大幅度的增加，且ZmmiR399的表达量肯定是和Pi缺乏的时间是相关的。

2、ZmMIR399过表达的转化玉米植株在地上部分的P积累

为了进一步调查ZmMIR399的功能，我们构建了ZmMIR399b过表达的转化玉米植株，利用农杆菌作为中介将ZmMIR399b的前提序列导入玉米自交系ZZCO1未成熟的胚胎中，根据ZmMIR399b的表达情况，选出了两个独立的转化时间，图1B。在水培条件下评估ZmMIR399b过表达转化玉米对低Pi的应答。由于ZmPHTs是ZmMIR399的潜在靶标，且PHT与PHO2不是同系物，所以在拟南芥和水稻中的miR399过表达植株中出现的P中毒表型不会出现在玉米的转化株中，但是在Pi缺乏条件下，ZmMIR399b过表达的玉米植株出现了典型的P中毒表型，在老叶的顶端和边缘有萎黄或坏死，见1B。在Pi缺乏条件下，ZmMIR399b过表达的玉米老叶的P浓度是野生型的2倍，见图1C。而在根中，野生型的总P浓度比转化玉米的浓度高16-25%，见图1C。相比之下，在P缺乏条件下野生型和转化株根和地上部分的干重是相似的。

3、ZmPHO2是ZmmiR399的靶标

ZmMIR399b过表达的玉米在P缺乏条件下的p中毒的表型在拟南芥的pho2突变体的表型得到了重现，所以这引发我们去研究ZmMIR399b过表达的玉米中的ZmPHO2的转录水平，即使ZmPHO2不是ZmmiR3999的预测靶标。在玉米中，GRMZM2G381709和GRMZM2G464572与拟南芥中的PHO2是同源的。在MaizeGDB上，我们发现GRMZM2G381709和GRMZM2G464572的cDNA序列是一致的，因此我们设计了引物，在ZmMIR399b的过表达转化玉米中去检测GRMZM2G381709和GRMZM2G464572的转录本。

如图2A，ZmMIR399b过表达显著降低了玉米中GRMZM2G381709/GRMZM2G464572的表达水平，为了进一步检测GRMZM2G381709/GRMZM2G464572与ZmmiR399的的关系，我们首先证实了GRMZM2G381709和GRMZM2G464572在玉米中的注释，我们使用5，RACE，克隆到一个1276bp的一个片段。通过MaizeGDB，我们在原来预测到的GRMZM2G381709的5，UTR加上一个1165bp的一个片段。进一步的分析显示，新克隆的GRMZM2G381709的5，UTR有6个ZmmiR399的切割位点。感兴趣的是，我们对ZmPHO2的5，RACE产物的30个克隆进行测序，发现每一个片段都属于GRMZM2G381709，这说明在玉米中有很少或没有GRMZM2G464572的转录本。GRMZM2G381709被叫做ZmPHO2。

我们接下来用两个miR399结构（ZmMIR399b和ZmMIR399bmut将6个突变引入到ZmMIR399b的成熟序列中）在烟草中做瞬时转化。如图2B，当与ZmMIR399b共表达时，ZmPHO2转录本显著增加，但是与ZmMIR399bmut共表达时却不受影响（见图2C）。另外，我们使用缺pi胁迫六天的玉米苗子的RNA，通过5，RACE检测到6个ZmPHO2的预测靶标中的4个，见图2D。这些结果显示，在玉米中ZmPHO2是ZmmiR399的靶标，miR399-PHO2调控模块在玉米中是保守的，和在拟南芥和水稻中一样。

4、在磷高效和磷低效玉米中检测ZmmiR399和ZmPHO2的表达水平

之前根据磷高效株系CCM454和磷低效株系31778在pi缺乏条件下的RNA-seq转录组分析，我们鉴定到了差异表达基因有22个miRNA属于10个miRNA家族，包括miRNA399家族。在本研究中，我们执行了一个时序实验来检测在磷高效和磷低效株系中的ZmmiR399的表达水平。如图3A，在pi缺乏条件下的磷高效株系CCM454和磷低效株系31778中ZmmiR399的表达量都是上调的。意外地是，如图3A，miR399诱导的ZmPHO2后转录抑制仅在CCM454中检测到。与此相反，在31778株系中，在pi缺乏下，ZmmiR399的表达虽然是增加的，但是ZmPHO2的转录本也是上调的。

为了验证这些结果，我们还检测了另外三株磷低效株系（FR19、1538、J1419）和三株磷高效株系（X114、HAI9-21、Q1261）的ZmmiR399的表达，这些株系是通过560个株系中鉴定出来的。如图3B，其结果与在31778和CCM454中是一致的，除了Q1261以外。在磷缺乏处理7天后，ZmPHO2转录本在磷高效株系中是下调的，在磷低效株系中是上调的。

为了进一步验证在低磷胁迫的玉米中miRNA/PHO2之间的关系，用磷低效株Qi205和磷高效株CCM454进行杂交，构建分离群体。从F2:3家系中随机选择出来100个株系去确定水培条件下的低磷胁迫情况。选择出10个最耐和10个最感的株系，再从剩余的80个株系中选出来10个株系作为对照。在低磷胁迫下，这些株系的ZmmiR399是上调的。在磷高效株系中，观察到通过ZmmiR399诱导的ZmPHO2是下调的。这些结果表明，在玉米中miR399诱导的ZmOHO2后转录抑制增加了对磷缺乏的耐性。

5、与ZmmiR399相关的lncRNA的鉴定

为了阐明ZmmiR399诱导的ZmPHO2的调控在磷高效和磷低效玉米植株中的差异，我们首先在不同玉米植株中检查ZmmiR399与ZmPHO2结合位点的序列。除了Q1261以外，在磷高效株和磷低效株中ZmmiR399与ZmPHO2结合位点的序列是一致的。这表明在玉米中其他调控机制影响miR399诱导的ZmPHO2的表达。一种可能就是lncRNA。为了证实这种可能，我们利用低P胁迫2天和8天的林高效玉米CCM454和磷低效玉米31778的根和地上部分，构建链特异性文库。使用HISAT2和StringTie，一共从组装的转录组中鉴定到178771个定向转录本，然后用FEELnc和alignment-free软件进行评估，最终72429个转录本被鉴定出来，包含46972个lincRNAs，2511个lncNATs和1217个incRNAs。与之前的研究相一致，被鉴定出来的大多数（79%）lncRNAs由单个外显子组成，如图4A。lncRNA基因是相对短的，平均长度是788bp，仅有18%的lncRNA基因的长度是超过1kb的，见图4B。为了进一步证实预测到的lncRNA基因，我们随机选择了19个lincRNAs在低磷胁迫7天的玉米RNA进行克隆。随机选出的19个lincRNA中的16个通过RT-PCR被证实，见图4C。这些lncRNA通过测序被证实，这些结果也说明了我们的结果是可信的。

6、PILNCR1抑制ZmmiR399诱导ZmPHO2的切割

如图5A，由于lncRNA819包含ZmmiRNAd的一段互补区域，所以它吸引了我们的注意力。使用3，和5，RACE，一个不包含内含子的677bp的cDNA的序列被克隆出来。如图5B，在磷高效玉米CCM454和磷低效玉米31778植株中，lncRNA819被磷缺乏诱导显著表达，因此我们将lncRNA819叫做PILNCR1。

在之前的西红柿和拟南芥的报道中，在番茄中有TPSI家族中的好几个基因包含有miR399的互补区域。在这个家族中较大的成员是IPS1和其同源基因At4在拟南芥中影响miR399的切割。不像在拟南芥中，IPS1和At4编码一个保守肽，PILNCR1在玉米中缺乏编码肽的潜能。另外，在玉米中有3个候选ZmIPS1/ZmAt4。由于MaizeGDB的注释有低置信度，GRMZM2G086179不做进一步的考虑。GRMZM5G843352和GRMZM2G436295从DNA相反链的同一位置转录出来。做cDNA序列比对分析之后，发现PILNCR1与GRMZM5G843352和GRMZM2G436295没有同源性。进一步的共线性分析显示，PILNCR1和AtIPS1/AtAT4s不在同一条染色体上。以上结果总结显示，PILNCR1和AtIPS1/AtAT4s之间存在特征性差异。然后我们在本氏烟和玉米叶片的原生质体中执行瞬时表达去验证PILNCR1是否能影响植物中miR399的切割。

我们测试了两个PILNCR1结构：一个全长的PILNCR1和一个删掉了miR399的互补区域的结构（PILNCR1del）与本氏烟共表达两天后，提取RNA，通过RT-qPCR分析ZmPHO2的表达。见图5C，当ZmmiR399b和PILNCR1共表达时，ZmPHO2的表达被ZmmiR399b显著降低。然而，当ZmmiR399b与PILNCR1del共表达时，ZmPHO2的表达水平被显著降低，说明PILNCR1的互补区域对ZmmiR399的调控是非常重要的。图5D，当ZmmiR399b与玉米叶片的原生质体共表达时，同样的结果也被获得了。这些结果表明PILNCR1能有效较少ZmmiR399b的效应。

7、ZmmiR399b和PILNCR1的表达模式

为了进一步揭示ZmmiR399b和PILNCR1之间可能的关系，我们通过原位杂交验证ZmmiR399b和PILNCR1的表达模式。由于在磷充足条件下，ZmmiR399b和PILNCR1在玉米中的丰度比较低，于是去在pi缺乏条件下的第7天的玉米根和地上部分来验证ZmmiR399b和PILNCR1表达模式。ZmmiR399b和PILNCR1在玉米的根和地上部分均能被检测到，尤其是在维管束里，见图6A-B。这些结果显示ZmmiR399b和PILNCR1的空间定位至少有部分是重合的。

8、PILNCR1与玉米低磷胁迫是相关的

为了进一步调查玉米低磷胁迫时PILNCR1的功能，我们通过RT-qPCR，检测在磷高效玉米（CCM454、X114、HAI9-21、Q1261）和磷低效玉米（31778、FR19/1538、J1419）中PILNCR1的表达量。在pi缺乏条件下，在磷高效株和磷低效株中PILNCR1的表达量都是低的，见图7。然而，当玉米收到低P胁迫7天后，磷低效玉米株中的PILNCR1的表达量是磷高效株中的6倍。

总结

本研究发现在玉米中miR399特异性受低磷胁迫诱导上调表达；同时在miR399过表达的转基因玉米植株中磷由根部向地上部转运增多，导致转基因植株的成熟叶片边缘出现干枯坏死的磷中毒表型，表明miR399对于玉米体内磷稳态平衡具有重要作用。研究人员通过实验证实玉米中PHO2是miR399的靶基因，并对其进行重新注释，表明miR399-PHO2调控通路在玉米、拟南芥、水稻中是保守的。研究还发现玉米中miR399介导的PHO2转录后水平的切割主要出现在磷高效玉米自交系中。同时研究人员发现了一种长链非编码RNA——PILNCR1可与PHO2竞争性结合miR399，削弱了miR399对靶基因PHO2的剪切；并且在低磷胁迫条件下，磷低效玉米自交系中PILNCR1和miR399的表达丰度显著高于磷高效玉米自交系，高表达量的PILNCR1会结合较多的miR399，从而导致靶基因PHO2上调表达，表明PILNCR1和miR399的表达量与玉米耐受低磷胁迫的能力相关。