【项目文章】大豆冷胁迫研究文章解读

miRNA是一类内源性小RNA,长度为18-40nt,不编码蛋白。在植物中以降解mRNA或阻止mRNA翻译的方式起到重要作用。大多数已知的miRNA都会参与植物的生长发育过程,已经在拟南芥、杨树等植物中鉴定到了一类响应冷刺激的miRNA。大豆是一类重要的粮食作物,具有很高的营养成分。然而,冷胁迫会直接影响大豆的生长发育并导致产量的减少。今天小R就为大家分享一篇研究大豆冷胁迫下miRNA及其靶基因的作用机制的文章。

实验材料

大豆“Taiwan 75”培养在正常条件下,第一真叶期的幼苗分为对照组和处理组。对照组—25°C(12h),17°C(12h),处理组—4°C(24h)。设置3次生物学重复。

研究结果

1.sRNA测序数据统计
首先,对大豆4°C处理组(3h、6h、9h、12h、24h和36h)及对照组进行相对生长速率(RGR)和MDA含量的检测。发现在24h时,对照组和处理组RGR和MDA含量明显不同。因此,选择冷胁迫24h进行sRNA测序。

对照组和处理组分别获得6559098和8273245 clean reads。长度为21nt所占比例最高(图1A)。非冗余的reads,长度分布统计可以看出24nt所占比例最高,在对照组和处理组中分别为68.4%和59%(图1B)。

图1.sRNA长度分布图

2.鉴定大豆中已知的miRNA
共鉴定到已知的434个miRNA,属于133个家族。这些miRNA包括保守miRNA和种间特异性miRNA。保守miRNA在植物发育过程和响应胁迫上起到重要作用。通过同源比对鉴定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156,miR160,miR164等在很多植物物种中都是高度保守的。此外,找到一些非保守miRNA,例如miR3522,表明他们可能参与大豆的物种进化。

 

3.预测大豆中新的miRNA
根据miRNAs前体的发夹结构来预测miRNAs,找到3个预测的miRNA并鉴定折叠成的二级结构。

 

4.验证大豆中预测的miRNA
为了验证测序结果,利用qRT-PCR分析miRNA表达情况。选择了35个miRNA(33个已知miRNA,2个预测miRNA)进行qRT-PCR分析。线性回归分析测序结果和qRT-PCR结果相关性系数为0.8048,表明miRNA-Seq和qRT-PCR结果相一致。尽管miRNA-Seq和qRT-PCR结果在精确的倍数方面有些差异,这可能是由于2种实验结果敏感性和特异性的不同导致的,但是miRNA表达趋势是一致的。

图2.qRT-PCR结果

5.miRNA靶基因鉴定
利用降解组测序鉴定miRNA降解的靶基因。共获得12283683条raw reads,2623291条非冗余raw reads。共鉴定到898个转录本是54个miRNA家族的靶基因。本研究发现miRNAs可以降解2个甚至更多的靶基因,与之前的研究相似。例如,gma-miRNAs可以沉默属于SBP家族的15个基因,脱落酸响应结合因素蛋白家族和2个基因,2个转录因子等。而且,有7个转录本受到多个miRNAs的调控。

 

6.鉴定大豆冷胁迫下相关的miRNA
对miRNA进行差异表达分析,共鉴定到32个miRNA家族的51个miRNA差异表达。在冷胁迫下有30个下调表达,21个上调表达。

对相应靶基因进行功能注释来研究差异表达的miRNA可能行使的功能。差异表达的miRNA可以分为四类。第一类包括miRNA家族(miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327),靶基因为转录因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH,参与调控基因表达和信号传导。第二类包括miR4411,其对应靶基因涉及抵御疾病。第三类包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416,其对应靶基因参与植物生长发育中的适应性。为了进一步确认冷胁迫下miRNA和靶基因的关系,选择了5个miRNAs及其靶基因进行qRT-PCR验证。结果表明,在冷胁迫下miRNA-164a,miRNA-4411和miRNA-169e上调。相反的,他们的靶基因NAC、DRP和NFY显著下调。说明miRNA和对应靶基因呈负相关性。


图3.miRNA和对应靶基因qRT-PCR图

 

为了近一步确认这些差异表达miRNA的功能,对靶基因进行GO分析。靶基因共参与了56个分子功能terms,37个生物学过程terms和7个细胞组分terms。在分子功能分类下,ATP结合、蛋白结合、组蛋白结合等terms是显著富集的。超过35%miRNAs的靶基因参与了生物学过程途径。

 


图4.GO注释

结 论
首次研究大豆冷胁迫下miRNA调控基因表达情况。利用降解组测序鉴定到了上百个靶基因,揭示miRNAs和靶基因之前的相互关系。尽管miRNAs调控机制十分复杂,目前还不是十分清楚,本次研究完善了miRNA数据库,为研究大豆和其他物种的基因调控网络提供了重要基础。也发现了51个响应冷胁迫的miRNAs。

文章亮点
1.处理时间点的选择上进行了预实验,设置多个时间梯度进行处理并进行生理指标测定,最终选择变化较为明显的时期。选样时间点有理有据。
2.利用降解组测序准确鉴定miRNA降解的mRNA。

参考文献
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.

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