miRNA是一类内源性小RNA，长度为18-40nt，不编码蛋白。在植物中以降解mRNA或阻止mRNA翻译的方式起到重要作用。大多数已知的miRNA都会参与植物的生长发育过程，已经在拟南芥、杨树等植物中鉴定到了一类响应冷刺激的miRNA。大豆是一类重要的粮食作物，具有很高的营养成分。然而，冷胁迫会直接影响大豆的生长发育并导致产量的减少。今天小R就为大家分享一篇研究大豆冷胁迫下miRNA及其靶基因的作用机制的文章。
实验材料
大豆“Taiwan 75”培养在正常条件下，第一真叶期的幼苗分为对照组和处理组。对照组—25°C（12h），17°C（12h），处理组—4°C（24h）。设置3次生物学重复。
研究结果
1.sRNA测序数据统计
首先，对大豆4°C处理组（3h、6h、9h、12h、24h和36h）及对照组进行相对生长速率（RGR）和MDA含量的检测。发现在24h时，对照组和处理组RGR和MDA含量明显不同。因此，选择冷胁迫24h进行sRNA测序。
对照组和处理组分别获得6559098和8273245 clean reads。长度为21nt所占比例*高（图1A）。非冗余的reads，长度分布统计可以看出24nt所占比例*高，在对照组和处理组中分别为68.4%和59%（图1B）。
图1.sRNA长度分布图
2.鉴定大豆中已知的miRNA
共鉴定到已知的434个miRNA，属于133个家族。这些miRNA包括保守miRNA和种间特异性miRNA。保守miRNA在植物发育过程和响应胁迫上起到重要作用。通过同源比对鉴定大豆中保守的miRNA家族。例如miR156，miR160，miR164等在很多植物物种中都是高度保守的。此外，找到一些非保守miRNA，例如miR3522,表明他们可能参与大豆的物种进化。
3.预测大豆中新的miRNA
根据miRNAs前体的发夹结构来预测miRNAs，找到3个预测的miRNA并鉴定折叠成的二级结构。
4.验证大豆中预测的miRNA
为了验证测序结果，利用qRT-PCR分析miRNA表达情况。选择了35个miRNA（33个已知miRNA，2个预测miRNA）进行qRT-PCR分析。线性回归分析测序结果和qRT-PCR结果相关性系数为0.8048，表明miRNA-Seq和qRT-PCR结果相一致。尽管miRNA-Seq和qRT-PCR结果在√确的倍数方面有些差异，这可能是由于2种实验结果敏感性和特异性的不同导致的，但是miRNA表达趋势是一致的。
图2.qRT-PCR结果
5.miRNA靶基因鉴定
利用降解组测序鉴定miRNA降解的靶基因。共获得12283683条raw reads，2623291条非冗余raw reads。共鉴定到898个转录本是54个miRNA家族的靶基因。本研究发现miRNAs可以降解2个甚至更多的靶基因，与之前的研究相似。例如，gma-miRNAs可以沉默属于SBP家族的15个基因，脱落酸响应结合因素蛋白家族和2个基因，2个转录因子等。而且，有7个转录本受到多个miRNAs的调控。
6.鉴定大豆冷胁迫下相关的miRNA
对miRNA进行差异表达分析，共鉴定到32个miRNA家族的51个miRNA差异表达。在冷胁迫下有30个下调表达，21个上调表达。
对相应靶基因进行功能注释来研究差异表达的miRNA可能行使的功能。差异表达的miRNA可以分为四类。第一类包括miRNA家族（miR156、miR164、miR169、miR4412和miR5327），靶基因为转录因子SBP、NAC、NFY、GRAS和bHLH，参与调控基因表达和信号传导。第二类包括miR4411，其对应靶基因涉及抵御疾病。第三类包括miR5761、miR159、miR5667、miR1535、miR511、miR4382和miR4416，其对应靶基因参与植物生长发育中的适应性。为了进一步确认冷胁迫下miRNA和靶基因的关系，选择了5个miRNAs及其靶基因进行qRT-PCR验证。结果表明，在冷胁迫下miRNA-164a，miRNA-4411和miRNA-169e上调。相反的，他们的靶基因NAC、DRP和NFY显著下调。说明miRNA和对应靶基因呈负相关性。
图3.miRNA和对应靶基因qRT-PCR图
为了近一步确认这些差异表达miRNA的功能，对靶基因进行GO分析。靶基因共参与了56个分子功能terms，37个生物学过程terms和7个细胞组分terms。在分子功能分类下，ATP结合、蛋白结合、组蛋白结合等terms是显著富集的。超过35%miRNAs的靶基因参与了生物学过程途径。
图4.GO注释
结 论
首次研究大豆冷胁迫下miRNA调控基因表达情况。利用降解组测序鉴定到了上百个靶基因，揭示miRNAs和靶基因之前的相互关系。尽管miRNAs调控机制十分复杂，目前还不是十分清楚，本次研究完善了miRNA数据库，为研究大豆和其他物种的基因调控网络提供了重要基础。也发现了51个响应冷胁迫的miRNAs。
文章亮点
1.处理时间点的选择上进行了预实验，设置多个时间梯度进行处理并进行生理指标测定，最终选择变化较为明显的时期。选样时间点有理有据。
2.利用降解组测序z确鉴定miRNA降解的mRNA。
参考文献
[1] Xu S, Liu N, Mao W, et al. Identification of chilling-responsive microRNAs and their targets in vegetable soybean (Glycine max L.)[J]. Scientific Reports, 2016, 6.
京公网安备 11011302003368号