2019年7月22日，Nanopore平台全新测序芯片R10到达百迈客实验室，百迈客将开启ONT平台测序新征程！
近年来，由于三代测序相较于二代测序，拥有单分子无需扩增，长度长等优势，因此在各组学研究中大放异彩。而作为三代测序的代表技术之一，Nanopore平台因能获得更长读长，在基因组学研究中更是备受青睐。但相较于二代平台，三代平台测序数据的准确性一直是比较大的劣势。本次Oxford Nanopore Technologies公司即将推出的R10芯片，则剑指准确性。相较于当前广泛使用的R9.4.1芯片，新型R10芯片可提供相当的读长，产量及更准确的数据。
R10芯片测序原理
新升级R10芯片大的更新是纳米孔采用了双读取器（Reader）的设计，能够对同一碱基进行两次信号识别。理论上，同一碱基的识别次数为R9.4.1版本芯片2倍，由此来增加碱基的判断率，减小随机错误，并提高一致准确性。R10与R9.4.1测序方式比较如图1
图1 测芯片更新前后测序方式比较
01、单reads测序准确性：
目前主流的R9.4.1芯片的表现能力如何？我们随机抽取了200个已经完成常规ONT DNA测序的样品（包含各种动植物）进行统计，总共约22.4T数据（足够有代表性了），结果如下：
可以看到，R9.4.1芯片数据的读长是非常理想的：Reads N50高达到72 Kb，平均达到35 Kb；单分子读长高达到了1.6 Mb；而关于质量值平均为8.3，对应准确性为：85.21%；单个样品平均质量值高达到9.7，对应准确性为：89.28%；
R10的质量表现如何呢？我们统计了拿到的四个样品的数据，具体统计结果见下图：
图2 R10数据质量值分布
绝大部分R10 reads的质量值达到了10以上（对应准确性为90.0%），而平均质量值为12.1（对应准确性为93.8%），而reads质量值已经达到了15以上(对应准确性为96.84%)。由此可见，对于单条reads来说，提升还是非常明显的，平均reads准确性从85%提升到了93.8%。
02、Consensus序列准确：
看完单条reads准确性后，那么组装时用到的高深度consensus序列准确性怎么样呢？官方比较了同一样本不同芯片测结果的准确性，见图3。从结果可知，相同测序深度的情况下，consensus后序列的准确性Q值，R10比R9.4.1提升了5~10之间，对应的准确性有的提升了1个百分点之多。
图3 不同物种中R10和R9.4.1 reads准确度
从官方的数据显示，当数据深度为50X时，R10测序数据的consensus序列的准确性已经达到了Q44，即99.996%以上（图4）。且随着测序深度的增加，R10芯片一致准确性逐渐增加。官方对多物种测试发现，在100X的测序深度下，consensus准确性可以保持在Q45以上，在有些样本上甚至已达到Q50（99.999％）水平（图4），当然加大测序深度也可以想要达到更高水平，测试结果中，最高已经达到了Q52（99.9994%）。需要注意的是，这都是未经过二代测序数据矫正的结果！
图4 不同测序深度下R10 consensus序列准确性比较
03、同聚物识别准确性：
同聚物的识别准确性是大家一直都比较关心的问题，从ONT官方释放的测试结果显示，相比于R9.4.1，R10版本芯片能够显著提高其在同聚物区域的碱基识别准确度，并且几乎不会引入缺失错误（图5）。
图5 R10、R9.4.1芯片在同聚物区域的测序准确度
04、数据错误分布：
官方通过检测同一样本R10和R9.4.1中的错误在基因组上的情况，发现R9.4.1与R10的错误在基因组上分布并不是完全重叠的，通过两种版本芯片的数据进行混合分析，可极大地提高序列的准确性（图6）。这表明了，在不使用二代数据的前提下，后续也可考虑通过R10和R9.4.1数据组合的方式来提高结果的准确度！
图6 R10和R9.4.1错误分布情况
小结
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