空间转录组技术助力揭示肿瘤细胞 “自建城堡” 介导免疫治疗耐药新机制

四川大学华西医院在国际顶级期刊《PNAS》发表题为 “Acquired resistance to immunotherapy by physical barriers with cancer cell-expressing collagens in non-small cell lung cancer” 的重磅研究。

该研究首次发现肿瘤细胞自身分泌胶原蛋白形成双层物理屏障，阻断T细胞浸润和杀伤，导致免疫治疗耐药。空间转录组技术，为这一颠覆性发现提供了最关键的原位证据支撑，解决了传统单细胞测序丢失空间信息的核心痛点。百迈客生物为该研究提供了百创空间转录组BMKMANU S1000测序服务。

研究背景

免疫治疗彻底改写了癌症治疗格局，但获得性免疫治疗耐药（AIR）仍是临床最大瓶颈。数据显示，超过65%的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者在PD-1抑制剂初始响应后4年内复发，其核心机制长期未被阐明。

研究结果

构建临床精准的NSCLC免疫治疗耐药小鼠模型

为真实模拟临床患者的免疫治疗耐药过程，研究团队创新性地建立了”类器官起始精准模型（OPCM）”：从CGAS-Cas9-EGFP小鼠肺组织中培养上皮类器官，导入 sgTrp53、KrasG12D和Myc荧光素酶（TKM）构建恶性转化的类器官（图 1A）。将类器官原位移植到小鼠肺部，成功构建了与人类NSCLC高度相似的肿瘤模型（图 1B-G）。经抗PD-1抗体治疗后，小鼠先出现显著肿瘤消退，随后逐渐复发并产生耐药，完美复刻了临床患者的治疗全程（图 1H-J）。

通过转录组比对证实，该小鼠模型的耐药基因特征与临床NSCLC患者高度一致，且该特征可有效预测患者免疫治疗预后（图2F-G）。进一步的二次移植和体外共培养实验明确：这种获得性耐药是肿瘤细胞内在的特性，而非微环境外在因素导致（图 1K-M）。

多组学联合锁定关键分子：肿瘤细胞自分泌胶原蛋白

为解析肿瘤细胞内在的耐药机制，研究团队整合了单细胞转录组（scRNA-seq）、空间转录组和蛋白质组三大技术平台，开展了系统的分子特征分析：

scRNA-seq结果显示，耐药肿瘤中T细胞浸润量显著减少，且T细胞的早期活化和效应记忆标志物表达水平显著下调（图 3D-E）。

RNA-seq和蛋白质组学共同发现，胶原蛋白及胶原组装相关基因在耐药肿瘤细胞中显著高表达，其中Col3a1和Col6a1差异最为显著（图 3F）。

百创S1000空间转录组的核心贡献一：原位证明胶原由肿瘤细胞自身表达。

传统观点一直认为，肿瘤组织中的胶原蛋白仅由基质细胞（如CAFs）分泌。但百创S1000空间转录组技术以10μm的超高分辨率，首次在原位清晰展示了：

在敏感肿瘤中，Col3a1和Col6a1仅局限于基质区域表达；而在耐药肿瘤中，这两种胶原蛋白均匀分布于整个肿瘤区域，且与肿瘤细胞标志物共定位（图 4E-F）。

空间转录组数据直接在组织原位证明了：胶原蛋白的细胞来源是肿瘤细胞本身，而非传统认为的基质细胞。这一发现直接推翻了传统认知，证明耐药肿瘤细胞自身获得了分泌胶原蛋白的能力，为后续物理屏障机制的提出奠定了决定性基础。

 

空间+电镜联合：揭示”城堡+盔甲”双层物理屏障结构

为直观观察胶原蛋白的空间分布和超微结构，研究团队结合了空间转录组、免疫荧光、二次谐波成像（SHG）和电镜技术：免疫荧光染色显示，COL3A1 形成 “城堡状” 结构包围着一簇簇肿瘤细胞；COL6A1 形成 “盔甲状” 结构，包裹着每一个单独的肿瘤细胞（图 5A）。SHG显微镜证实，胶原纤维在耐药肿瘤中广泛分布，而在敏感肿瘤中仅局限于基质区域（图 5B）。透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）清晰显示，耐药肿瘤细胞表面覆盖着一层完整的胶原纤维层，而敏感肿瘤细胞表面则没有（图 5C-D）。

百创S1000空间转录组的核心贡献二：建立分子-结构-功能的空间关联。

百创S1000空间转录组不仅提供了基因表达的空间位置信息，更重要的是，精确展示了两种胶原的不同空间分布模式，解释了它们为何能形成不同结构的屏障；与免疫荧光染色结果完美对应，在分子水平验证了屏障的组成；为后续功能实验中 “破坏屏障可恢复T细胞浸润” 的结论提供了空间层面的因果证据。

功能验证：破坏胶原屏障可逆转免疫治疗耐药

为证明胶原屏障确实导致了免疫治疗耐药，研究团队进行了药物干预和基因编辑实验。

胶原酶治疗：将胶原酶I与抗PD-1抗体联合使用，可显著降解肿瘤中的胶原纤维（图 6C-E），增加CD8+T细胞的浸润（图 6F），并抑制耐药肿瘤的生长（图 6B）

基因敲除实验：单独敲除Col3a1或Col6a1对耐药性影响较小（图 6H）。同时敲除Col3a1和Col6a1（dKO）可完全去除肿瘤细胞表面的胶原纤维（图 6J），显著延长抗PD-1治疗小鼠的生存期（图 6I）。dKO仅在免疫健全小鼠中有效，在免疫缺陷小鼠中无效，证明其作用依赖于T细胞（图 6M-N）。

机制解析：TGFβ通路调控胶原合成，两种胶原分工明确

研究进一步揭示了胶原屏障形成的上游调控机制和两种胶原的不同功能：

上游调控：免疫治疗激活了肿瘤细胞中的TGFβ通路，TGFβ1可显著上调Col3a1和Col6a1的表达；敲除Tgfbr1则可抑制胶原的合成（图 3H-J）

功能分工：COL3A1形成的 “城堡状” 屏障主要负责阻止T细胞进入肿瘤组织（图 7B）。COL6A1形成的 “盔甲状” 屏障主要负责保护肿瘤细胞免受T细胞的直接杀伤（图 7C-E）。

百创S1000空间转录组的核心贡献三：为临床转化提供精准标志物

百创S1000空间转录组的结果直接指导了临床样本的验证：研究团队在15例获得性耐药的NSCLC患者样本中发现，6例患者的肿瘤细胞同时高表达COL3A1和COL6A1，而12例未接受免疫治疗的患者中无一例双阳性（图 8C-D）。胶原高表达的患者肿瘤中T细胞浸润显著减少（图 8E）。在多个独立临床队列中，COL3A1和COL6A1高表达均与免疫治疗患者的不良预后显著相关（图 8B）。

这表明，肿瘤细胞来源的COL3A1和COL6A1可作为预测免疫治疗疗效的新型生物标志物，而靶向TGFβ-胶原通路则为克服免疫治疗耐药提供了全新的治疗策略。

研究总结

该研究首次揭示了一种全新的肿瘤细胞内在免疫治疗耐药机制：肿瘤细胞通过激活TGFβ通路，自身分泌COL3A1和COL6A1形成 “城堡+盔甲” 双层物理屏障，分别阻断T细胞的浸润和杀伤。

百创空间产品矩阵

百创自主专利技术，可通过完全无错的原片高清明场图像+ 与明场图像完全对齐的原片荧光图像 + 原片高通量测序，“三片合一”进行精准的细胞分割，并以此为基础拓展到空间免疫组及原位荧光领域，建设起从空间转录组,空间表观调控到空间免疫组及下游原位验证一体化策略，为科研工作者提供了前所未有的研究视角。

01 百创S系列空间转录组

百创空间S系列空间转录组芯片：per spot直径为2.5μm，分辨率为3.5μm（相邻spot的中心距），捕获面积6.8mm*6.8mm至50mm*60mm。

02 百创S3000-VDJ空间免疫组

BMKMANU S3000-VDJ 技术，使用新鲜OCT包埋样本，在分辨率为3.5μm的芯片上同一张组织切片（10μm）实现3’端mRNA，以及全长TCR/BCR的捕获。利用百迈客生物智能制造独有的图像校准及细胞分割技术，得到单细胞级分辨率的空间转录组结果及单细胞级分辨率的空间T/BCR数据。

03 百创ISSeq原位荧光

百创RNA荧光原位检测产品ISSeq ，采用锁式探针、荧光探针及滚环扩增技术，精准捕获组织或细胞中RNA位置，是单细胞测序、空间转录组后续验证的黄金搭档，为科研人员提供可靠、精准的实验结果。

04 百创空间ATAC-seq

BMKMANU 空间ATAC-seq 技术，基于百创S系列空间芯片为基础进行拓展开发，对染色质开放片段进行捕获，临片进行空间转录组测序，实现“表观遗传-转录组”的多维数据整合。

百创DG1000单细胞文库制备系统

百创DG1000基于微流控，barcode标记利用油滴包裹能够大规模实现单细胞捕获的同时允许在单细胞水平直接分析基因表达。