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1、提取方法

1.1 植物组织：CTAB法

  1. 液氮研磨样品，分装至离心管中
  2. 向离心管中加入 CTAB，水浴
  3. 离心后向上清中加入氯仿/异戊醇（24:1），离心
  4. 向上清中加入异丙醇和乙酸钠溶液，离心，弃上清
  5. 加入 75％乙醇，离心，弃上清
  6. 晾干，加入 TE  溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2 动物组织：SDS法

  1. 液氮研磨组织样，分装至离心管中
  2. 加入 SDS 溶液，水浴
  3. 加入 NaCl 溶液，静置后离心
  4. 向上清中加入氯仿/异戊醇（24:1）后离心
  5. 向上清中加入异丙醇后离心，弃上清
  6. 加入 75％乙醇，离心，弃上清
  7. 晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3 动物血液：Kurabo 试剂盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，厂家：Kurabo，货号：40321300101

1.4 粗体核酸纯化

试剂盒名称：QIAGEN Genomic-tip 20/G，厂家：QIAGEN，货号：10223

试剂盒名称：QIAGEN Genomic-tip 100/G，厂家：QIAGEN，货号：10243

1.5 微生物样本

使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒完成核酸的提取

2、检测方法

2.1 检测方法

  • 浓度检测

Nanodrop：赛默飞 Thermo ，型号 NANODROP2000

Qubit：厂家YEASEN, 型号CAT 12642-A ，试剂1XdsDNA HS Assay kit for Qubit

  • 完整性检测（琼脂糖凝胶电泳）

电泳仪：厂家：天能 Tanon ，型号 EPS600

电泳槽：厂家：天根生化科技（北京）有限公司，型号：HE- 120

2.2 判定标准

  • 总量≥2μg（单次建库）
  • 浓度≥50ng/ul
  • 体积≥10(ul)
  • OD260/280在7-2.2之间，OD260/230在1.0-3.0之间
  • AGE：size≥23K，降解条带>5K，点样孔无或有轻微污染，N/Q在8-2.5之间
  • 样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

注：特殊物种实验人员会根据经验进行判断，具体以检测报告中的判断结果为准

3、建库方法

3.1 建库流程

  1. 准备高质量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化
  2. 使用BluePippin进行片段筛选
  3. 使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的损伤修复和末端修复加 A
  4. 使用无扩增条形码扩展试剂盒添加 barcode 序列
  5. 使用无扩增条形码扩展试剂盒完成测序接头的连接

3.2 建库试剂

  • 文库构建试剂：NEBNext FFPE DNA Repair Mix货号 M6630L 厂家 NEB
  • 文库构建试剂：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module货号E7546L  厂家NEB
  • 文库构建试剂：无扩增条形码扩展试剂盒1-96  货号SQK-NBD114.96 厂家Nanopore

3.3 建库设备

  • 数字 3*32PCR 仪  厂家 Appliedbiosystems   仪器规格 proflex3*32
  • 制冷型程控五段金属浴  厂家 天根生化科技（北京）有限公司  仪器规格 OSE-DB-02

4、测序方法

4.1 上机操作

  • 用测序芯片制备试剂盒配制 Flow cell Priming mix
  • 用测序辅助扩展试剂盒配置上机文库
  • 用 PromethION  Flow  Cells 芯片，在PromethION48测序仪运行MinKnow 软件，开始测序，默认运行72 小时

4.2 测序试剂

  • 测序芯片制备试剂盒  货号 EXP-FLP004   厂家 Nanopore
  • 测序辅助扩展试剂盒  货号 EXP-AUX003  厂家 Naonopore
  • 测序芯片  PromethION Flow Cell(R10.4.1)  货号 FLO-PRO114M   厂家 Nanopore

4.3 测序设备

PromethION48 测序仪  厂家 Nanopore   仪器规格 PromethION48

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