SLAF实验流程材料方法

 

1、提取方法

1)样本研磨

2)将装有样品的离心管加入1 ml 65 ℃预热的CTAB提取液和2%的巯基乙醇（如 果是动物组织的话加50ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K），在涡旋振荡仪上震荡混匀，使样品完全悬浮，65 ℃烘箱温浴40 -60min，不能超过1h

3)温浴期间摇匀2-3次，保证裂解充分。取出后，冷却至室温

4)12000 rpm离心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 无菌离心管中（。加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm离心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 无菌离心管，加入等体积三氯甲烷-异戊醇 （24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm离心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml无菌离心管中，加入上清液体积的2/3体积（300ul）的异丙醇和1/10体积（45ul）的3M乙酸钠，充分混匀，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm离心10min（如果从-20℃取出后絮状沉淀较多，可12000rpm离心20s），弃上清，瞬时离心，用200ul枪头吸弃多余液体

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，轻弹至沉淀悬浮，12000rpm离心5min，弃上清

9)瞬时离心，用黄枪头吸弃多余液体，离心管开盖室温晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明状

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超纯水，根据沉淀大小决定融水体积，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴锅消化1 h后保存在-20 ℃冰箱备用

注：常规植物组织提取正常使用CTAB提取，疑难植物（蔷薇科等多糖类植物）组织裂解前使用干扰（清洗掉部分多糖等杂质）先清洗，清洗完之后在加裂解液；动物组织在裂解时加入2%的蛋白酶K；宏基因组项目提取在裂解时加入5%-10%的溶菌酶

2、检测方法

2.1检测方法

使用 使用 Qubit（厂家YEASEN, 型号CAT 12642-A ，试剂1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）检测核酸浓度，使用1%的琼脂糖电泳检测完整性

2.2判定标准

浓度≥5ng/ul

总量大于等于8 0 ng

主带清晰、主带不清晰，主要弥散在2K以上

核酸状态正常

3、建库方法

3.1建库流程图

3.2样本稀释

1)核对任务单中项目样品基本信息，根据信息单一一对应排好样本

2)根据标准用量，计算“稀释后浓度(ng/μL)”和“吸取体积(μL)”

3)取已灭菌的国产96孔PCR板，在板子上标注相应的项目编号、板号、日期及稀释字样，并开始稀释

4)稀释后，震荡轻混（勿剧烈震荡）并瞬时离心，对稀释后的样品取2 μL做Nanodrop 检测

5)如果浓度与理论浓度偏差较大先检查样品是否用错，在确认样品使用无误的情况下，浓度高的加水稀释，浓度低的加DNA或者重新稀释

3.3步骤A

根据任务单的酶切方案选择下面所列单酶切或双酶切方案，取适当起始量样本，进行37℃酶切反应，在水浴锅中反应时长不超过15h

3.4步骤B

在上述反应产物中加入试剂，在PCR仪器中进行3′端加A处理

3.5步骤C

向上述产物中加入一定体积的连接试剂及index，充分混匀，进行Dual-index测序接头反应

3.6PCR 扩增及电泳检测

1)加入 PCR 反应所需的各种试剂，混匀，离心

2)根据 PCR 反应条件，放入 PCR 仪中进行 PCR 扩增

3)对PCR产物进行电泳检测

3.7PCR 产物的纯化及电泳检测

1)将全部PCR产物进行磁珠纯化

A.将MagicPure Size Selection DNA Beads（全式金）磁珠提前 30min 室温平衡备用

B.将PCR产物转入 1.5mL 离心管中，加入（0.8 X）体积已混匀的磁珠，吹吸混匀

C.旋转混匀仪上，室温混匀，瞬时离心，而后置于磁力架上，静置，移弃上清液

D.离心管置于磁力架上，向离心管中加入新鲜配制的 80%乙醇，磁力架上静置 30s，移弃上清液

E.重复步骤（4）一次，第二次清洗后，瞬时离心，用 10μL 枪头将上清液去除干净

F.离心管置于磁力架上，打开管盖，室温干燥至磁珠表面无光泽，有细微裂纹

G.取下离心管，加入无菌水，吹吸混匀，室温静置，而后磁力架上静置，吸取上清液转入新的 0.2mL PCR 管中

2)对PCR纯化产物进行电泳检测

3.8定量及混样

1)将PCR纯化产物进行Nanodrop 定量

2)根据上机数据量及定量结果，电泳结果，回收胶电泳上样量，进行混样量计算

3)向1.5ml离心管中按照计算好的混样量，加入PCR纯化产物，并混合均匀

3.9电泳切胶

1)配制2%电泳回收胶

2)使用TAE跑电泳，根据下单规定的切胶范围进行切胶

3)对切胶片段进行过柱纯化回收

3.10上机文库构建PCR扩增

1)在上述胶回收产物中加入 PCR 反应所需的各种试剂，混匀，离心

2)根据 PCR 反应条件，放入 PCR 仪中进行 PCR 扩增及纯化

3.11上机文库准备

将PCR纯化产物出库，进行后续文库质检及上机测序

3.12文库质检

1)质检方法：文库通过 Qsep-400进行片段质检， 使用 Qubit 3 .0进行文库浓度的定量

2)质检标准：浓度≥1ng/ul ，峰图在要求切胶范围之内，片段单一无杂峰

3.13建库试剂耗材

1)文库构建试剂：NEB（New England Biolabs）（使用的是单个散装试剂，不是成套试剂盒，具体试剂保密）

2)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 货号N411-03

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

3.14建库设备

4、测序方法

测序设备：NovaSeq X plus

测序试剂盒：NovaSeqTMX  Series25B Rgt Kit