目前研究表明,5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和 5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC) 是哺乳动物基因组中最常见的两种表观遗传标记。此外,当5mC在基因启动子中水平升高时,5mC会抑制基因转录。5hmC可能是5mC氧化产物的中间体,并且还稳定地参与到基因组DNA中,具有很高的稳定性。在启动子区域用 5hmC 替换 5mC 可以重新激活基因转录。因此,区分甲基化和羟甲基化启动子至关重要。目前用于分析DNA甲基化的“金标准”是亚硫酸氢盐测序,统计分析的是甲基化 (5mC) 和羟甲基化 (5hmC) 的总和 。而纳米孔测序技术(nanopore,ONT)可以直接从天然的DNA链中检测5mC,精准分析甲基化水平。百迈客是中国大陆目前首家且唯一一家全部通过 PromthION/GridION平台及DNA/RNA样本官方认证的公司。截至目前为止,百迈客ONT平台已经建立超过上百种物种类型的文库,拥有大量的项目经验!无论是技术还是项目经验上,我们都实力过硬!

摘要

多个肿瘤抑制基因(TSG)的下调在癌症形成中起重要作用。最近的证据表明,癌症进展涉及表观遗传修饰的全基因组改变,这可能导致肿瘤抑制基因的下调。针对肝细胞癌 (HCC) 细胞,利用纳米孔测序技术在全基因组范围内绘制5-甲基胞嘧啶信号以识别新的TSG。甲基化数据与再生肝脏和原发性HCC的转录谱数据的整合分析共鉴定到13个潜在的肿瘤抑制基因候选者。随后专注于对一种候选物——葡萄糖激酶 (GCK) 进行功能表征的验证。结果表明,GCK的过表达通过诱导细胞内乳酸积累来抑制HCC细胞的增殖,也由于NAD+耗竭而导致能量危机。这表明GCK作为肿瘤抑制基因发挥作用,可能参与HCC的发展。

背景介绍

肝细胞癌 (HCC) 是全球最常见的肿瘤类型之一;然而,目前的治疗选择有限,没有精确有效的医疗策略。HCC通常发生在慢性肝病的背景下,其风险因素包括病毒性或自身免疫性肝炎、慢性酒精滥用和非酒精性脂肪肝。这些风险因素会引发异常的肝脏再生,从而引发HCC的形成。然而,潜在的分子机制仍然很大程度上未知。

据报道,失调的DNA甲基化是HCC发病机制中的早期事件之一。此外,近期有研究数据表明多个肿瘤抑制基因如CDKN2A、HNF4A和TTP,通过启动子甲基化的发生在HCC细胞和再生的肝细胞增殖中起关键作用的,提示启动子甲基化让TSG表达失调可能是HCC形成的一个重要因素。因此,新型TSG的鉴定将为阐述HCC形成的分子机制提供线索。

材料方法

实验材料:HepG2、Huh7、C3A 和 HLF 细胞(肝癌细胞系)

实验技术:ONT甲基化测序,EPIC测序,免疫组织化学 (IHC),免疫印迹杂交,RT-PCR,葡萄糖-6-磷酸(Glucose 6-P)测定,乳酸测定,NAD+/NADH测定,ATP 测定,结晶紫实验

结果

一、HCC细胞中高甲基化基因的鉴定

利用ONT平台对HCC细胞系 (HepG2) 进行测序,并和HepG2细胞的全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS) 数据进行比较分析,如图1A所示,ONT测序的甲基化信号与 WGBS的甲基化信号具有良好的相关性。ONT测序数据发现甲基化水平在转录起始位点 (TSS) 下降(图1B),ONT测序数据和WGBS数据分别检测到3332和5099个基因的3711和7013个高甲基化启动子(图1C)。发现通过ONT测序检测到的87%的高甲基化基因(2904个基因)也同时被WGBS检测到(图1D)。接下来分析了只有WGBS数据检测到的2195个高甲基化基因的ONT测序覆盖率,以识别可能的羟甲基化基因,发现有489个至少有5条ONT测序的reads覆盖,但是软件并没有检测到有5mc甲基化水平(图1E),提示这些可能是羟甲基化。这些数据表明利用ONT测序数据分析5mC,能够将5mC 与胞嘧啶的其他修饰区分开。为了进一步提取高度可信的甲基化信号,针对约3000万个CpG位点进行了EPIC测序,在ONT测序数据和WGBS数据中检测到的2904个高甲基化基因,有1637个可以通过EPIC测序验证(图1G)。


图1 肝细胞癌中高5mC甲基化的基因鉴定

二、HCC中识别新型TSG候选者

在肝再生过程中,增殖基因被激活,而抗增殖基因被抑制,从而使静止的肝细胞重新进入细胞周期。本研究选取小鼠三分之二肝部分切除术 (PH) 之前和之后四小时检测高甲基化基因的表达水平,挑选标准是与对照假手术(SH)相比表达量下调超过两倍的基因,以及这些基因应该在部分肝切除术后一周内恢复表达量(图2A)。基于这些标准,选取了56个基因。之后在TCGA的 371 个人类原发性 HCC和50个正常肝脏的RNA-seq数据中比较这些基因的表达,发现13 个在 HCC 中下调超过两倍(图2BC),其中有3个基因已知是肿瘤抑制基因(图 2C) ,分别是粘附连接相关蛋白 1 (AJAP1)、GATA 结合蛋白 5 (GATA5) 和卵磷脂视黄醇酰基转移酶 (LRAT) 。此外,其余10个潜在的抑癌基因具有不同的功能,包括转录调控 (NFATC2)、细胞迁移 (EFS和CXCL12)、葡萄糖代谢 (GCK) 和细胞生长 (PTH1R 和 SH3YL1)。


图2 候鉴定选肿瘤抑制基因

三、葡萄糖激酶 (GCK)的异位表达抑制HCC细胞的增殖

由于葡萄糖代谢的重编程是 HCC 的标志之一,进一步关注表征一种TSG 候选物 – 葡萄糖激酶 (GCK) 的抗增殖作用。为了检验GCK是否可能在HCC 细胞中发挥抑癌基因的作用,首先分析了GCK在正常人肝脏和四种HCC细胞系中的表达,即Huh7、HepG2、C3A 细胞和 HLF 细胞(图3A)。发现GCK在正常肝脏中高表达,在Huh7、HepG2、C3A细胞和HLF细胞中未检测到有表达。然后在这些细胞系中过表达带有FLAG 标记的GCK(图3B) ,并使用结晶紫实验检查细胞生长。GCK 的过表达强烈抑制 HepG2 和 C3A 细胞的生长,而在 HLF 和 Huh7 细胞中生长抑制的效果不太明显,但仍很显著(图3C)。利用增殖标记物Ki67进行的免疫组化染色证实了过表达GCK的HepG2和C3A细胞生长受到抑制(图3D)。为了检查GCK过表达后HepG2和C3A细胞的减少,是否是因为增殖受到抑制和受到凋亡诱导,对凋亡标记物PARP进行了免疫印迹杂交实验。如图3E所示,在GCK过表达的细胞中PARP没有增加。这些数据表明GCK的过表达抑制细胞增殖但不诱导细胞凋亡。


图3 GCK的过表达抑制细胞增殖

四、葡萄糖激酶的异位表达导致细胞内乳酸积累

研究表明在高糖培养基培养的大鼠肝癌细胞中,葡萄糖激酶的过表达会诱导葡萄糖摄取和高水平的乳酸积累。值得注意的是,本研究的细胞也是在高葡萄糖培养基中培养的。因此,检测了对照和GCK过表达细胞中细胞内葡萄糖6-磷酸(葡萄糖 6-P)和乳酸的含量。尽管在HepG2和Huh7细胞中GCK过表达后 Glucose 6-P水平都是增加的(图4A),但是细胞内乳酸仅在HepG2细胞中显著积累(图4B)。丙酮酸转化为乳酸脱氢酶的过程在NAD+的再生中起关键作用,在高浓度的乳酸下,乳酸脱氢酶表现出反馈抑制,NAD+再生率降低。NAD+在糖酵解过程中被还原为NADH,需要持续供应NAD+以维持连续的高糖酵解速率和最佳细胞生长速率。NAD+/NADH比率的下降与细胞增殖的减少相关。因此,接下来检测了细胞内乳酸积累对NAD+再生和ATP产生的影响。如图4C所示,在GCK过表达的细胞中NAD+/NADH比率显著下降,并伴随着ATP水平的降低(图4D),提示NAD+消耗导致了细胞内乳酸积累而引起能量危机。


图4 GCK过表达导致细胞内乳酸积累并引起能量危机

 

五、MCT2 是减少 GCK 过表达细胞中细胞内乳酸积累所必需的

由于GCK过表达并未强烈诱导Huh7细胞中的乳酸积累,这就提出了乳酸是如何在这些细胞中外排的问题。乳酸外排由双向单羧酸转运体(MCTs)介导,已知有四种MCT可转运乳酸,因此检测了在 Huh7 和 HepG2 细胞中MCT变异体的表达。有趣的是,HepG2细胞仅表达MCT1和MCT4,而Huh7 细胞表达了三种变异体(图4E)。还通过免疫印迹杂交实验证实了HepG2 细胞中缺乏 MCT2的表达(图4F)。这些数据提出了随后的问题,即细胞内乳酸积累是否由于HepG2细胞中缺乏MCT2所致。为了检验这种可能性,耗尽了GCK过表达的Huh7细胞中的MCT2(图4G) 并检测了细胞内乳酸的浓度。事实上,MCT2 的消耗显著诱导了乳酸的积累(图4H)。因此,在MCT2耗尽的细胞中,NAD+/NADH 比率显著下降(图4I) 并伴随细胞增殖的减少(图4J)。总之,这些数据表明MCT2的缺乏在GCK过表达的细胞中显著积累了乳酸。

 

讨论

通过应用纳米孔测序技术对HCC基因组中高度可信的5-甲基胞嘧啶信号进行了分析,并确定了具有生物学意义的肿瘤抑制基因候选者,这些候选基因在 HCC 中被表观遗传沉默。这项工作导致在HCC中发现和表征一种作为肿瘤抑制基因的基因,并为未来的分析提供了多种候选基因。数据表明纳米孔测序产生的甲基化信号与 WGBS 相关性良好。还表明这项技术能够将5mC与胞嘧啶的其他修饰区分开来,例如5hmC(羟甲基化)。这说明纳米孔测序是适用于鉴定高甲基化TSG的方法。总之,这些数据为进一步研究人类癌症的肿瘤发生过程提供了有价值的线索。

 

参考文章

Davenport CF, Scheithauer T, Dunst A, et al. Genome-Wide Methylation Mapping Using Nanopore Sequencing Technology Identifies Novel Tumor Suppressor Genes in Hepatocellular Carcinoma. Int J Mol Sci. 2021;22(8):3937. Published 2021 Apr 11. doi:10.3390/ijms22083937

 

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