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英文名称:N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg efect: implication in colorectal cancer

中文名称:N6-甲基腺苷(m6A)阅读蛋白IMP2能稳定ZFAS1/OLA1轴并激活沃伯格效应:在结直肠癌中的意义

杂志名称:J Hematol Oncol.

影响因子:17.233

摘要

背景:越来越多的证据表明N6-甲基腺嘌呤(m6A)调节因子有助于结直肠癌(CRC)的病因学和进展研究。然而,参与糖酵解代谢的m6A阅读蛋白的确切机制仍然模糊不清。本文旨在将m6A阅读蛋白与糖代谢串联起来,揭示一种CRC进展的新机制。

方法:通过生物信息学、ISH和IHC检测,分析了候选lncRNA和m6A阅读蛋白之间的关系。利用体内和体外研究(包括MTT、CFA、反式孔、细胞凋亡、免疫印迹、qRT-PCR和异种移植小鼠模型)来探讨这些指标的生物学功能。利用乳酸检测、ATP活性检测和ECAR检测验证其下游靶点的生物学功能。利用生物信息学、RNA稳定性、RIP实验和RNA下拉实验探索其潜在的分子机制。

结果:本文发现在CRC增殖和进展过程中,m6A阅读蛋白IMP2与长链非编码RNA(lncRNA)ZFAS1以依赖m6A调节的方式进行串联,随后增强了OBG-样ATPsae1(OLA1)和腺嘌呤三磷酸(ATP)水解和糖酵解的募集。

材料方法

实验样本:144对CRC组织和对应的癌旁组织;CRC细胞系和正常人肠道上皮细胞系

实验方法:lncRNA-mRNA芯片测序,qPCR,WB蛋白印迹分析,组织微阵列(TMA)和免疫组化(IHC),lncRNA ISH检测,细胞增殖实验,细胞克隆实验(CFA),细胞凋亡检测,细胞迁移实验,免疫荧光实验(IF),m6A斑点实验,RNA稳定性测定, RNA下拉实验 ,RIP-PCR检测,ATP含量检测,LD含量检测,ATP酶活性检测,细胞外酸化速率测定(能发高分文章的秘诀)。

结果

1、CRC细胞和组织中lncRNA的失调与IMP1/2/3的表达相关

在CRC组织中,只有IMP2表达量比较高,且远高于IMP1和IMP3(图1b)。同样发现IMP2在7个CRC细胞系((LOVO,CACO2,SW48,SW480,HT29,HCT116和 SW620)中的表达量也高于结直肠上皮细胞中的表达量(图1c)。而m6A斑点实验检测结果表明,总m6A在CRC细胞系(特别是HCT116、SW620和HT29细胞系)中的水平要高于正常结直肠上皮细胞(图1d)。这和之前对IMP2的功能研究结论一致,即稳定RNA的表达,增加总RNA的m6A水平。

然后分析了m6A阅读蛋白IMP1/2/3的RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)数据以及TCGA中的数据,获得了7个候选的lncRNA。其中ZFAS1、SNHG15和CRNDE表现出明显的高表达(图1e)。在CRC细胞中,ZFAS1表现出最明显的高表达(图1f)。在IMP1/2/3和ZFAS1之间计算相关性,发现ZFAS1和IMP2之间存在明显的正相关(图1g)。

为了研究IMP2在ZFAS1表达中的潜在作用及其相关的m6A甲基化水平,本文进行了组织微阵列(TMA)、RNA原位杂交(ISH)和免疫组化(IHC)检测,分析CRC组织样本和对应的癌旁组织(n=144)中IMP、m6A和ZFAS1的表达(图1h)。值得注意的是,在CRC组织中,IMP2、ZFAS1的表达和m6A的甲基化水平急剧增加(图1i)。进一步进行相关模式分析,表明IMP2和ZFAS1的表达和m6A水平呈现正相关性(图1j)。

为了进一步探讨这些指标在队列中作为独立预后因素的临床效用,对144例CRC组织和癌旁组织进行了秩和检验和多变量cox回归分析,发现IMP2表达量的升高显著缩短了总生存期(OS)和无病生存期(DFS),m6A甲基化的高表达与不良的OS和DFA显著相关,而ZFAS1表达量高的CRC患者的OS急剧下降。DFS也明显下降(图1k)。说明IMP2、m6A和ZFAS1的表达与CRC患者的生存状况有着明显的相关性。

总之,这些结果表明IMP2在CRC细胞和组织中高表达,并伴随着相关的m6A甲基化水平和ZFAS1的表达。这些指标也表示了其作为独立的预后预测因子的潜在功能,可用于未来的CRC评估和治疗的生物标志物。


图1(上下滑动查看)

2、CRC细胞中IMP2通过直接与ZFAS1的m6A位点结合促进ZFAS1的稳定性

为了探索在CRC肿瘤发生发展过程中,IMP2介导的m6A甲基化稳定性及其相关的ZFAS1表达的关键生物学特征,在HCT116和SW620细胞系中检测干扰IMP2后的IMP2和ZFAS1的表达。结果表明异位IMP2的表达明显地增强了ZFAS1和IMP2的表达。然而通过qPCR定量分析发现IMP2的敲除抑制了HCT116和SW620中ZFAS1和IMP2的表达(图2b)。在IMP2敲除的CRC细胞中,通过上调ZFAS1的表达来进行拯救实验,通过qPCR发现ZFAS1的表达的确得到了恢复(图2c)。更重要的是,RNA稳定性分析进一步确定了与空载体处理的细胞相比,IMP2敲除或在不同时间点(0,2,4,6 h)进行放线菌素D治疗的HCT116和SW620 细胞中ZFAS1 RNA的半衰期是减少的(图2d)。这些发现说明IMP2作为一个m6A阅读蛋白对ZFAS1有稳定作用。

为了验证IMP2和ZFAS1之间的直接关联,初步分析了FLAG标记的IMP1/2/3的RIP-seq数据,发现和对照相比,异位IMP2的表达极大地丰富了HEK293T细胞的内源性ZFAS1(图2e)。此外,RNA结合蛋白的数据说明IMP2蛋白有一个特定的结合域可以识别ZFAS1中的m6A motif(图2f)。为了进一步验证IMP2和ZFAS1结合位点的可靠性,进行了共定位的ISH和免疫荧光(IF)检测,结果发现ZFAS1和IMP2的表达分布相一致,主要结合位点在HCT116和SW620的细胞质中,部分在细胞核中(图2j)。RIP分析发现相比对照组,用m6A抗体富集得到了更高表达的ZFAS1(图2k),RNA下拉实验说明了通过携带m6A motif与IMP2蛋白特定结构域可以直接结合(图2m)。利用qPCR验证IMP2 KH3-4的WT和Mut载体处理后的HEK293T细胞中ZFAS1的表达,发现表达量显著减少(图2i),说明IMP2 KH3-4结构域可以与ZFAS1直接相互作用。

以上数据结果说明IMP2通过KH3-4直接与ZFAS1上的m6A位点结合,并增强了ZFAS1的稳定性(图2a)。

 


图2(上下滑动查看)

3、IMP2通过调节ZFAS1在CRC细胞中的表达来调控生物学特性

为了进一步明确在CRC细胞中IMP2和ZFAS1特异性的调控模式,首先通过MTT实验(图3b)和细胞克隆实验(CFA)(图3c)分析了干扰IMP2表达后的HCT116和SW620细胞系的细胞增殖能力和细胞克隆能力。结果发现异位IMP2的表达显著促进了CRC细胞的生长和克隆能力,而IMP2的耗竭抑制了CRC细胞的增殖。此外还检测了细胞侵袭能力(图3d),发现在沉默IMP2时,细胞的迁移受到了明显的抑制,而IMP2的过表达极大地提高了HCT116和SW620细胞系的侵袭能力。还发现IMP2的敲除增加了CRC细胞的凋亡率,IMP2的过表达会抑制CRC细胞的凋亡率(图3e)。后续通过拯救实验表明ZFAS1的过表达逆转了对CRC细胞的促进作用,包括细胞增殖能力、细胞克隆能力、细胞迁移能力和细胞凋亡率(图3f-i)。
这些结果说明IMP2通过促进ZFAS1的稳定性和表达来增加CRC细胞的增殖,抑制CRC细胞的凋亡,并促进细胞侵袭和转移,而IMP2对细胞表型的影响可以通过调节ZFAS1的表达来恢复。


图3(上下滑动查看)

 

4、在CRC细胞中鉴定到OLA1是IMP2稳定的的ZFAS1的关键靶点

为了进一步挖掘影响CRC细胞表型和功能的ZFAS1的下游靶点,在CRC细胞中进行了相关的功能研究。首先通过热图分析发现了与ZFAS1过表达正相关的潜在下游靶点,并通过公开数据集进行验证(图4a,b)。交集结果中发现了线粒体能量代谢相关基因OLA1,进一步通过qPCR检测发现与对照细胞相比,OLA1在7个CRC细胞系中显著过表达(图4c)。同样在CRC组织和癌旁组织的qPCR结果中发现,OLA1的表达在CRC组织中更高(图4d)。结果说明OLA1在CRC的组织和细胞样本中都是高表达的,且OLA1和ZFAS1的表达模式高度一致。

随后采用TMA和IHC检测OLA1的表达(图4e),通过RCO曲线评估OLA1的低/高表达,发现与对照组相比,CRC组织中观察到明显的OLA1表达,表现出致癌基因的特性(图4e,f)。且OLA1与ZFAS1的表达存在正相关性(图4g)。与临床数据做相关性分析,结果表明OLA1低表达的患者占比较高(图4h),OLA1高表达的CRC患者的DFS和OS时间明显缩短了(图4i)。后续针对OLA1是否是ZFAS1的下游靶点做验证,IMP2沉默/过表达不仅降低/增加了OLA1 mRNA的表达,而且降低/增加了OLA1蛋白的表达。但是IMP2对OLA1的影响可以被ZFAS2完全逆转(图4j-l)。

这些发现表明在CRC细胞和组织中,OLA1受到被m6A修饰和m6A稳定的ZFAS1表达的正向调控,进一步的预后评估揭示OLA1可以成为预测CRC临床结果的一个潜在生物标志物。

 


图4(上下滑动查看)

 

5、ZFAS1通过与OLA1的OBG型功能域结合增强OLA1的活性并激活糖酵解代谢

接下来通过ISH和IF实验证明ZFAS1和OLA1在CRC细胞中的共定位。结果表明,OLA1和ZFAS1不仅持续分布在HCT116和SW620细胞系的细胞质中,而且还分布在细胞核中(图5b)。为了确定ZFAS1是否与OLA1有直接的结合位点,并研究ZFAS1中关键的m6A位点对OLA1的影响,本研究将ZFAS1的三个A碱基替换成U碱基,并重新预测了
ZFAS1的三级结构。有趣的是,ZFAS1-WT和ZFAS1-Mut都是与OLA1的OBG型功能域结合,而且ZFAS1-WT和OLA1的结合强度远远高于ZFAS1-Mut和OLA1的结合强度(图5c)。RNA下拉实验表明,ZFAS1-WT的探针能显著下拉OLA1,而当ZFAS1的m6A位点发生突变时,ZFAS1-WT不能再下来OLA1(图5d)。所有结果说明OLA1蛋白特异性结构域能和含有ZFAS1-OLA1结合motif之间有直接结合作用。此外,OLA1表达的减少导致其ATP酶活性的降低,而ZFAS1的过度表达可以恢复OLA1的ATP酶活性。但是当ZFAS1的关键m6A位点发生突变时,ZFAS1对OLA1的ATP酶活性的恢复作用也消失了(图5e)。这也证明了ZFAS1对OLA1的ATP酶活性的促进作用取决于ZFAS1和OLA1的结合。

接下来探索OLA1的ATP酶活性的变化对CRC细胞能量代谢的影响,研究了HCT116和SW620细胞系中乳酸和ATP的含量。发现OLA1表达的减少不仅可以降低乳酸的积累,还可以减少细胞中ATP的含量(图5f,g)。通过细胞外酸化率的测定检测OLA1的变化对CRC细胞的糖酵解代谢能力的影响,发现OLA1表达的减少可以显著降低CRC细胞的糖酵解代谢能力,ZFAS1-WT可以恢复OLA1表达减少对CRC细胞糖酵解代谢能力的影响(图5h)。

总之,ZFAS1可以直接与OLA1的OBG型功能域结合,从而增强OLA1的ATP水解能力,促进乳酸的积累,激活了CRC细胞的糖酵解途径,最终促进CRC能量的释放(图5a)。


图5(上下滑动查看)

 

6、IMP2-ZFAS1-OLA1信号轴影响到线粒体能量代谢

通过电子显微镜观察到IMP2沉默后线粒体形态发生变化,即发现CRC细胞中线粒体明显肿胀和受损,IMP2沉默后线粒体的形态回复正常(图6b)。同时IMP2的过度表达促进了HK2(糖酵解的关键蛋白)的表达,抑制了PDHA1(氧化磷酸化的关键蛋白)的表达(图6c)。然而ZFAS1沉默/过度表达和IMP2过表达/沉默后,HK2和PDHA1的表达水平得到恢复(图6d)。

IMP2的过度表达明显增强了乳酸和ATP的释放,还发现IMP2敲除导致乳酸和ATP含量的释放大幅度减少,而ZFAS1可以完全逆转IMP2的影响(图6e,f)。细胞能量代谢检测进一步表明IMP2沉默减弱了细胞的糖酵解代谢能力,而ZFAS1可以逆转IMP2沉默对糖酵解水平降低的影响(图6g,h)。

总而言之,这些发现表明IMP2以依赖m6A的方式稳定ZFAS1的表达,与OLA1介导的线粒体能量代谢有着重要的联系。

图6(上下滑动查看)

 

7、IMP2在体内通过稳定ZFAS1促进细胞增殖

利用异体移植模型验证IMP2-ZFAS1-OLA1信号轴在体内的生物学功能(图7a),预后评估显示异种移植小鼠在与shIMP2和ZFAS1载体共同转染后,生存时间明显缩短(图7b),表明IMP2和ZFAS1在CRC预后评估中具有协同作用。此外,转染shIMP2载体的异种移植小鼠中,肿瘤体积、大小和重量都明显减少;然而,在与shIMP2和ZFAS1载体共同转染后,肿瘤体积、大小和重量急剧增加(图7c-e)。实验结果说明在异种移植模型中,ZFAS1的过表达明显地逆转了IMP2沉默对肿瘤生长的抑制作用(图7f)。

总之,体内实验表明,通过利用m6A诱导的稳定性的IMP2与ZFAS1/OLA1轴的相互作用,IMP2敲除抑制了异种移植模型的肿瘤生长和恶化。

图7(上下滑动查看)

结论

本文揭示了IMP2-ZFAS1-OLA1信号轴在CRC肿瘤的发生发展中的新调节机制。在CRC细胞中,IMP2正向调节lncRNA ZFAS1。异位IMP1增强了ZFAS1的稳定性和表达,而敲除IMP2会抑制ZFAS1的表达。基于RNA识别的motif,IMP2蛋白的KH3-4结构域在功能上被认为是直接与RNA结合的结构域,促进了ZFAS1中+843 m6A位点的RNA识别。此外,ZFAS1直接与OLA1结合,增强了OLA1的ATP酶活性,介导了线粒体的能量代谢,包括ATP水解和糖酵解代谢的生物过程,并最终影响到CRC细胞命运。总的来说,本文在结直肠癌预防和治疗中发现了一个新的信号轴,即识别到新的靶点和将m6A表观遗传修饰与线粒体能量转换串联起来。

图8(上下滑动查看)

 

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参考文章:

Lu S, Han L, Hu X, et al. N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021;14(1):188. Published 2021 Nov 7. doi:10.1186/s13045-021-01204-0

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