植物类样品制备方法及运输指南

1、前言

1.1适用范围

本指南介绍百迈客动物类组织&核酸样品的送样要求及制备方法。采集送样前请详细阅读。信息单中样本名称、组织部位必须与实物相符，避免因信息单与实物不符导致反复核对，影响样本质量、录入周期，导致提取核酸质量不满足建库测序要求，实验周期过长等

1.2提取风险提示

核酸提取质量与物种及组织部位、样本制备、样本交接、提取方法与操作、以及环境等因素息息相关，尤其是三代超长提取对样的要求更高。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，望老师知悉理解，并做好组织备份。为保障获得相对较高质量的核酸，请老师务必按照以下指导原则准备样本。对于珍贵样本或微量样本，建议自行提取

2、组织送样量要求

注意：未在表格出现的物种，请单独沟通。送样量结果展示为满足提取一次的量，如样品经过特殊处理或样本状态异常有几率影响得率，为了保证您的实验可以顺利进行，请酌情增加送样量

2.1常规植物组织送样要求

3、核酸送样要求

1)核酸送样需要提供相关检测结果，DNA类核酸可提供以下检测手段中的一种或多种检测结果： Qubit、 NanoDrop、 AGE，同时请采取适当的纯化方法，以避免多糖、多酚、蛋白或者核酸酶对DNA样品的污染，并详细注明溶解DNA所使用的溶解液类型

2)如果您开展的实验项目为miRNA的相关实验，并且提供的是总RNA的样本，请务必确认您采用的总RNA的提取方法保留了小RNA （ 包括miRNA），提取试剂盒型号备注送样信息单中

3.1二代DNA送样量要求

3.2三代DNA送样量要求

3.3RNA类送样量要求

1)针对核酸有杂质、污染、粘稠、颜色等情况，需要过柱纯化后送样或者酌情增加送样量

2)核酸样品建议使用1.5ml、2ml EP管装载样品，其他保存管容易破裂且不利于保存样品和后续实验的开展

3)为了防止样品污染和混淆，禁止使用96孔板和深孔板装载样品

4)用乙醇沉淀的样品由于运输中会有少量乙醇挥发，建议将样品管盖用封口膜缠绕4-5圈

5)考虑到核酸可能存在含有杂质、颜色等物质导致会产生大量损失的风险，为保证样本一次检测合格并节约宝贵的重送样时间，送样建议量是高于公司判定标准的，请在核酸量足够的前提下尽量按照送样建议来送样

4、样品制备保存指南

4.1常规植物类样本（不含藻类）制备流程

由于老叶或其它组织DNA&RNA含量可能较低，而次生代谢物含量一般相对较高，因此，为降低DNA&RNA提取难度并减少污染物干扰，请尽量选择健康、幼嫩的叶片组织；不建议选择易带有寄生或共生生物的组织，以及不易清洗和研磨的根、茎等组织致密的器官。另外藻类组织中的水分会影响提取得率，取样时需将组织样中的水分吸干。建议在采集样本之前，将样本置于黑暗环境24-48小时后再制备样本（停止光合作用，减少代谢干扰），新鲜组织样采样流程如下：

1)用清水将材料表面的灰尘及泥土冲洗干净，吸干，再从植物体上取下新鲜组织（注：如果是需要进行处理，请在活体上进行处理后再取样

2)如果组织体积较大，将组织剪切成 50-100 mg小块,约黄豆大小的小块,放入提前准备好的冻存管中

3)处理好的组织样本混合均匀后立即保存于提前标记编号、液氮预冷的2 mL 或更大体积的旋盖冻存管中，根据组织样本量选择核酸冻存管

4)液氮冻存前将样品分割成 50~100 mg 左右的小块，处理好的组织样本混合均匀后保存于提前标记编号、液氮预冷的2 mL 或更大体积的旋盖冻存管中，根据组织样本量选择核酸冻存管

5)迅速置于液氮中冷冻 1~2 h，然后按照顺序依次放入样品盒中（不建议自封袋送样），转移至-80 °C长期保存（禁止乱放，尤其是项目中样品个数较多时），干冰运输

注：植物组织不建议使用组织保护液保存。对于一些需要剥去种皮处理的，因样品速冻后无法准确剔除，如有需要剥去种皮的老师须自行操作

4.2Ultra Long ONT类植物样本

4.2.1植物组织选取及取样步骤

1)准备剪刀、镊子、锡箔纸，选取新鲜幼嫩的组织， 例如幼嫩的叶片（也可以是新长出的幼嫩根尖）

2)除去枯萎的，损伤的部分，除去茎，叶柄和粗的叶脉

3)将组织清理干净，可放在容器中用水冲洗，除去杂质和其他残余碎片

4)将清洗干净的样本倒在吸水纸上，再盖上一张吸水纸用手轻轻压几次（注意不要太用力损伤 叶片），水尽可能除去

5)将叶片称量一下，每0.5g/管（推荐使用 50ml 离心管）装好，标注样本名称，日期，准确重量

6)放入液氮快速冷冻 10min，转入-80 °C 冰箱保存，干冰运输

7)叶片剪下后的称量等操作，请在 10min 内完成，时间过长会导致叶片失水不可用，部分地区气温较高失水更快，操作时间需更短

4.2.2注意事项与说明

1)叶片要幼嫩的、新鲜的 、完整的（不要有损伤），可用手对比老叶和嫩叶的触感，嫩叶的触感非常柔软

2)林木 、灌木类的请根据生长周期来确定采样时间， 最好是发芽后长出来的嫩叶

3)禾本科黄化苗 1-2 周，最好有专门的黄化经验，黄化太过会造成细胞核难提取 。如果不会黄化就送 1-2 周刚长出来的叶片，具体生长时间需根据植物的生长状态判断

4)组培苗，不建议直接使用，尽量移植到土壤中培育出植株，取新长出的幼嫩叶片，若使用组培苗送样，请客户多准备备份样本

5)送样前请拍照记录样品状态

5、注意事项

核酸提取质量与物种及组织部位、采集方法及保存状态、提取方法及操作、实验器材及环境等因素均有密不可分的联系，尤其是三代超长提取对样本的质量、总量要求更高，望知悉及理解，并做好样本备份。为了保障获得高质量的核酸，请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本，建议自行提取

1)组织速冻时间：组织离体后，胞内核酸便开始降解，尤其是 RNA，故采集时，目的组织离体后，需立即速冻，建议 3min 内完成，越快越好。速冻时间过短会导致速冻不彻底，核酸有降解风险

2)组织送样量：建议送样量适用于 95%的物种组织，少部分组织因胞内核酸量较低，需适当增加送样量，比如动物皮肤、毛发等。请严格按照上方组织送样量要求送样，送样量过少或过多均不利于提取实验。采样量较少会导致提取的核酸总量、浓度不合格，采样量过多反而会造成速冻不彻底、提取取样困难、冻融降解等危险

3)组织状态：不建议送组织状态差或非生长旺盛期样品，核酸有一定几率降解

4)组织保存管的选择：所有组织样品务必使用离心管或螺纹管保存，切勿直接装入密封袋（低温冻脆易破裂，导致样品泄露，交叉污染）保存

5)组织样品保存方法选择：首选液氮速冻；没有液氮条件的，可直接放入-80℃冰箱冻存。未使用液氮速冻或液氮速冻时间过短都有一定几率导致核酸降解

6)组织送样方式的选择：干冰运输，且需要保证干冰的充足，冰袋和常温送样，有几率导致核酸的降解。除RNA类样品可使用RNAlater保存送样，其余产品均建议送速冻组织，不建议使用保护液送样，化开离心会有几率导致核酸降解；不建议酒精送样，固定不彻底，有一定几率残留核酸酶，降解核酸

7)冻融组织： 组织冻存后，一旦冻融，核酸降解概率大于 80%，几乎不可能提取成功，此类组织不建议送样。请各位老师送样前注意组织保存状态， 确保组织未发生过冻融情况

8)带血组织：由于血液没有专业的保护剂，去除不净一起速冻送样会影响组织的完整性

9)长年保存的组织：保存时间超过一年的组织不建议送样

10)组织分离要求：正常组织样本中不能含有病变组织，而病变组织样本中也不可以夹带有正常组织，提取实验时无法精确取样，无法称重。组织量过多的不能全部取样，只随机选取适量组织提取

11)对于同一个组织样品需要同时提取 DNA和 RNA 的，请务必分成两管分批次送样。样本的特殊处理包括：盐处理、温度处理、药物处理、病毒侵染、伤害处理、干旱处理等胁迫处理方式，不同程度的处理对样本的核酸质量会造成不同程度的影响，常见的会导致核酸 的降解或者得率降低。因此，经过特殊处理的样本，在送样时，务必请在样本信息单中进行详细的备注，以便尽量提高提取的成功率和避免样本的浪费

6、不合格样品存在风险

6.1样本总量不足、浓度过低存在风险

1)文库构建失败

2)文库产量低不能上机测序或测序数据量不足

3)导致数据随机性异常

4)数据质量差

6.2降解样本风险

1)文库构建失败

2)文库产量低不能上机测序或测序数据量不足

3)导致数据随机性异常

4)数据质量差

5)导致数据duplication比例高、随机性差

6)导致Small RNA rRNA比例高，影响有效数据，文库片段异常

6.3蛋白或其他杂质污染

1)可能影响Small RNA电泳分离，造成切胶不准，影响问题质量

2)可能影响RNA-seq磁珠分离导致建库失败，或即使达到上机要求也可能导致文库随机性差等问题

3)文库构建失败

4)文库产量低不能上机测序或测序数据量不足

6.4目标RNA含量低

1)总RNA达到要求，但由于样本特异性，small RNA含量低于正常样本，导致建库失败

2)总RNA达到要求，但由于处理或组织部位的特异性，mRNA降解或含量低，导致建库失败或者测序数据中rRNA 数据比例高