【成功案例】四川大学华西医院利用ONT测序平台进行新冠病毒全基因组测序

导读

研究背景

1. 非靶向宏基因组序列:11个样本使用Illumina NextSeq 500测序
2. 多重PCR +纳米孔测序，制备MinION文库
3. 转录组测序、Sanger测序
4. Nsp1过表达和qRT-PCR、免疫共沉淀、ELISA、荧光素酶检测、空斑试验

研究结果

与20家医院和研究机构合作，分析了在2020年1月22日至2月20日期间在中国四川省收集的流行病学、遗传和临床数据。2020年1-2月底，四川省经qPCR检测确诊病例538例，其中成都病例占28.8%（图1A）。四川确诊病例呈指数增长，2020年1月30日达到高峰，每天新增确诊病例38例（图1B）。若人员更密集，发生病例的频率更高（图1C），表明社交距离可能是防止病毒传播的一个关键因素。

图1 四川省SARS-CoV-2的时空流行病学研究

为了鉴定SARS-CoV-2病毒的遗传变异，利用ARTIC生信分析流程鉴定单核苷酸多态性(SNPs)和插入和缺失(indels)。在四川队列的88个SARSCoV-2基因组中共发现104个snp和18个indel（图1D）。大多数变异是单例，即只在一个基因组中观察到。在鉴别出的变异中，31个SNPs和4个indels存在于2个以上的患者中（图2A）。

对截至2020年11月9日存放在GISAID上的81391个高质量公共基因组序列进行分析，其中35个snp中有29个(82.8%)来自其他大洲;一些变异(C3037T、G26144T、C8782T、T28144C、G11083T和C18060T)在欧洲、非洲、大洋洲和美国流行，表明大多数snp已经在世界范围内流行。与武汉人群的比较显示，四川和武汉都存在另外四种变体，这些复发型包括三个Indels:Δ500-532, ACC18108AT和Δ729-737；一个SNP:T13243C（图2A），表明这些变异可能是从武汉输入的，与四川患者的旅行记录一致。

图2A 在不同大陆或地区研究的35个重复遗传变异的样本百分比

值得注意的是，在Nsp1编码区有两个缺失，Δ500-532和Δ729-737，在四川观察到23例(26%)和2例(2.2%)；在武汉观察到39例(24%)和4例(3%)。对Δ500-532的基因组进行了研究，发现它在系统发育树的不同簇中分布稀疏（图2B）。结果表明Δ500-532发生在多个城市，并可能从武汉多次输入，这与缺失Δ500-532的四川患者中有83.3%的人有去过武汉的旅行史相一致。

图2B SARS-CoV-2基因组系统发育分析

为了研究鉴定出的35个SARS-CoV-2复发遗传变异(31个snp和4个indel)的潜在临床意义，比较了出现严重或非严重症状的患者的临床表型，将19个严重相关表型分为(11个)严重表型和(8个)非严重表型（图3A）。

 图3A 与COVID-19严重程度相关的显著特征的火山图

采用类似GSEA的分析方法，来鉴定一个突变体是否富集严重/非严重的临床表型。发现Δ500-532与ESR等严重相关表型呈负相关。基于有/没有某种变异类型，将病例分为两组，发现感染Δ500 -532病毒的患者在所有检测的35种变异中Ct值最高（图3E）。

 图3D Δ500 -532的性状富集情况;

图3E qPCR检测中，有或没有某一Ct值变体的组之间的NES和p值

计算了SARS-CoV-2基因组中每个碱基对的缺失频率，Δ500-532位点是第五大最常见的缺失区域（图4A）。测序结果支持高序列深度的缺失，并通过Sanger测序验证了缺失（图4B）。从GISAID的37个国家的922例病例中，在Δ500-532位点找到了24种缺失变异（图4C）。其中62.5%和19.8%分别来自欧洲和北美（图4D），主要变种为Δ518-520 (Δ1aa), Δ518-523 (Δ2aa)和Δ509-523(Δ5aa)（图4E）。因此，研究结果显示SARS-CoV-2基因组中存在一个缺失热点，相关病例数量在全球范围内稳步上升。

图4 SARS-CoV-2基因组Δ500-532位点缺失变异的患病率

Δ500-532导致SARS-CoV-2 Nsp1 N端A₇₉PHGHVMVELV₈₉缺失11个氨基酸残基，在预测的模型中，Δ500-532对应区域的残基形成一个中央β链，如果去除该β链，可能会导致桶状折叠的完全破坏（图5A）。

SARS-CoV-2 Nsp1的C端结构域与40S核糖体亚基结合并干扰mRNA的进入，但实验发现突变的SARS-CoV-2 Nsp1保留了与40S核糖体亚基的结合能力（图5B）。

 图5 A Δ500-532基因座(橙色)在SARS-CoV-2 Nsp1 N端预测三维结构上的映射；

图5 B SARS-CoV-2 Nsp1突变蛋白结合40S核糖体亚基

GO富集分析发现，与WT Nsp1相比，突变体Nsp1在生“肽的生物合成/代谢过程”，“核糖核蛋白复合生物发生”，“靶向膜/内质网的蛋白质”，“mRNA代谢过程”和“无意义介导的衰变”等方面显著上调，符合报道的SARS-CoV-2 Nsp1的功能（图5D）。

值得注意的是，与GFP对照相比，WT中编码核糖体蛋白(RPs)的mRNA代谢过程通路中的许多基因下调。相比之下，有两个缺失组表现出不同于WT更类似于GFP对照的表达模式(图5E)。这些结果表明，Nsp1中这些N端缺失可能影响其在mRNA和蛋白质代谢过程中的功能

图5 C-E

由于Δ500-532在感染患者中与血清 IFN-β水平呈负相关，下一步评估缺失如何影响I型干扰素(IFN-I)应答。转染了HEK293T和A549(人肺细胞系)的细胞中，所有缺失变异均显示IFN-I反应降低。进一步进行了IFNB1启动子控制的荧光素酶报告基因检测和对转染的A549细胞进行转录组测序，系列接过说明IFN-I信号在缺失突变体中被下调。

图6G 与表达WT Nsp1的A549细胞相比，Δ500-532突变体中干扰素信号通路显著下调（绿色表示下调，红色表示上调）

为了研究Nsp1缺失对SARS-CoV-2病毒的影响，我们从临床样本中分离出WT、Δ518-520 (Δ1aa)和Δ509-517 (Δ3aa) Nsp1的毒株，实验感染Calu-3细胞。实验发现，Nsp1缺失突变体具有复制能力，在Calu-3细胞中表现出与WT病毒相似的生长动力学，并诱导较低的IFN-I反应。这些结果支持在关联研究中观察到的Δ500-532与血清IFN-b降低之间的关联。