分类： 转录组测序
0

Nanopore全长转录组由于其长读长、低碱基偏好性，同时完成基因水平及转录本水平定量的高性价比的优势，越来越多的应用于新转录本发现、可变剪接发现、转录本水平定量等方向的研究，目前已经产出多篇高分文章。今天和大家一起分享一篇Nanopore全长转录组测序技术在中医药领域上应用研究的文章。

英文题目：Full-length transcriptome analysis reveals the mechanism of acupuncture at PC6 improves cardiac function in myocardial ischemia model

发表期刊：Chinese Medicine

影响因子：5.455

发表单位：成都中医药大学

原文链接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34238326

研究背景

 

心肌缺血(MI)是一种严重的心血管疾病，具有高发病率和死亡率的特点。心肌缺血的病理过程非常复杂。针刺内观穴（PC6）已被证实对心肌梗死有效，但其机制尚不清楚。本研究通过全长转录组研究了针刺对心肌梗死影响的机制，本研究将有助于为心肌梗死寻找新的治疗靶点，为针刺研究提供独特的视角。

材料方法

成年雄性C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组、MI组和PC6组。MI组小鼠为通过结扎冠状动脉左前降支(LAD)形成MI模型，PC6组在造模完成后，针刺内关穴治疗5天后取材。经胸超声心动图评估MI手术前后小鼠心功能情况，并进行血清心肌酶和炎症细胞因子的测定，之后三组样本各取3个重复，共9个样本进行ONT全长转录组测序。

主要结果

一、针刺PC6穴位可有效保护心肌免受MI损伤

为了探讨针刺PC6穴对心肌损伤的影响，作者首先评估了心功能和梗死面积。超声心动图结果显示MI组的EF（ejection fraction）和FS（fractional shortening）均较对照组明显降低。PC6穴位治疗后，EF和FS均增加。针刺治疗5天后, 采用TTC染色检测梗死面积。结果显示，针刺治疗显著减小心肌损伤的大小。采用ELISA法测定反映急性心肌损伤的心肌特异性血清酶，包括心肌肌钙蛋白T (cTnT)和心肌肌钙蛋白I (cTnI)的水平。结果表明，心肌梗死术后cTnT和cTnI水平升高，针刺可显著降低血清酶水平。

二、针刺PC6穴位广泛改变基因表达

为了探讨针刺治疗心肌梗死的机制，作者利用纳米孔完成了不同组的基因表达检测。RNA-seq结果显示，与对照组相比，MI组有5083个差异表达基因，PC6组与MI组相比有324个差异表达基因。通过聚类分析将对照组、MI组和PC6组中上调和下调基因制作热图和维恩图，发现MI组2773个差异基因上调，针刺治疗下调了其中的65个差异基因，同时，在MI组的2308个下调的差异基因中，针刺治疗可逆转19个差异基因的表达。作者推测这84个差异基因可能是针刺抗心肌缺血作用的关键靶点。基于STRING数据库对MI和PC6共同调控的差异基因进行蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络分析。结果表明，蛋白质主要富集了4类，主要包括：炎症反应，肌动蛋白细胞骨架的调节，I型干扰素介导的信号通路，以及RNA聚合酶II基因DNA在核外周的转录依赖链。

三、炎症反应的验证

差异基因主要富集在炎症反应信号通路中，通过HE染色显示MI组炎性细胞大量积聚，针刺可明显减少炎性细胞浸润。检测血清中炎性细胞因子的水平显示MI组血清TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-1β(白细胞介素-1β)、IL-6(白细胞介素-6)水平较对照组升高，针刺可降低这些炎性细胞因子水平，并通过PCR进行了验证。


四、整合心肌缺血的可变剪接事件

已有研究报道可变剪接（AS）参与心肌缺血的发生发展。作者在每组中发现了大量的AS。在所有RNA-seq检测的样本中，共发现与1994个基因相关的8237个AS事件。并对不同类型的可变剪接时间进行了统计，结果表明，一个基因可能发生多种类型的mRNA剪接事件;部分基因可能有3种AS类型表达，半数以上的AS事件是ES类型的事件。差异表达基因和AS事件相关基因分析结果显示许多差异基因经历了AS事件，表明许多基因可能在MI的病理过程和针刺选择性剪接治疗中发挥作用。KEGG富集分析结果发现AS相关基因主要富集在线粒体组织、蛋白酶体蛋白分解代谢过程、RNA剪接、通过剪接体剪接mRNA以及代谢过程等途径。

 

五、心肌缺血的差异选择性剪接事件分析

差异AS分析结果显示，本研究共鉴定出347个差异AS事件，其中上调174个，下调173个。AS上调事件数量与AS下调事件数量相同。与对照组相比，MI组有129例AS事件差异上调，147例AS事件差异下调。与MI组相比，PC6组有45个AS事件差异上调，26个AS事件差异下调。通过GO和KEGG富集分析，作者发现这些基因富集的前10个通路包括核糖体、HIF-1信号通路、肥厚型心肌病、扩张型心肌病。结果表明，这些参与差异AS事件的基因与心脏病有关。

六、在全长转录组中检测到的新基因的分析

全长转录组可以准确识别转录本结构从而鉴定新转录本。本研究中一共鉴定到了602个新基因。这些新基因大部分为9个样本共享，说明这些新基因可以在所有样本中稳定表达。也有一些新的基因仅在MI组和PC6组表达，说明在病理条件下这些基因表达模式发生了变化（图B)。对照组新基因表达模式与MI组和PC6组差异显著;而MI组与PC6组有相似的新基因表达模式。维恩图分析差异新基因的重叠部分，结果发现MI组3个上调基因在针刺后下调，只有1个下调的新基因通过针刺表达上调。


总结

作者证明针刺PC6可以改善心功能，减少梗死损伤。通过ONT全长转录组准确的鉴定出的转录本结构信息，作者发现针刺可以调节差异表达基因和可变剪接，并预测这可能会影响蛋白质的结构和功能。作者还检测到针刺治疗后表达发生变化的4个新的基因，这些基因可能是针刺治疗心肌梗死的靶点。基于这些结果，作者得到针刺治疗心肌缺血可能是通过转录组的多方面调控的结论。

ONT全长转录组产品促销活动正在火热进行中，欢迎各位老师来电咨询：400-600-3186

 

最近文章