引言
2021年12月4日，大连海洋大学海洋科学与环境学院在JCR Q1区期刊《Water Research》上发表了题为“Metagenomics combined with comprehensive validation as a public health risk assessment tool for urban and agricultural run-off”的研究论文，该论文提出了一个由病原体筛选、病原体基因分型和风险评估三个阶段组成的公共健康风险评估流程：1）运用宏基因组测序、微流控芯片和qPCR对病原体进行筛选，2）多位点序列分型(MLST)或常规PCR进行病原菌分离和基因分型；3）对宏基因组数据的毒力基因进行致病性评估。
译名：宏基因组学结合综合验证作为城市和农业径流公共健康风险评估工具
期刊：Water Research
影响因子：11.236
发表时间：2021年12月4日
合作单位：大连海洋大学海洋科技与环境学院
研究方法：宏基因组测序；微流控芯片；qPCR；MLST分型
研究背景
水生病原体可引起严重疾病，如霍乱、钩端螺旋体病、伤寒或腹泻。鉴于这些新出现的疾病的不可预测性和高度多样性，水传播病原体监测的关键挑战之一是优先为局部暴发做好准备。为应对这些挑战，该研究分三个步骤进行公共卫生风险评估：潜在病原体筛选、病原基因型确认、与当地临床资料比较。
摘要
研究者选择了两个具有潜在公共卫生问题的地区(东港和湛江)进行了宏基因组测序，对毒力基因进行了致病性评估。结果表明，共检测到90多种细菌病原体，其中56种含有毒力基因。在东港，发现了一株致病性不动杆菌属(Acinetobacter sp.)，在2018年和2020年达到了较高的丰度，所有致病性弧菌都在2019年10月达到顶峰。在湛江，鲍曼不动杆菌（A. baumanni）等肠杆菌科细菌种类在2019年和2020年大量存在，而气单胞菌属（Aeromonas）和弧菌属（Vibrio spp）在2017年11月浓度达到顶峰。通过MLST对40个菌种进行了分离与分型，其中一半是临床上的流行基因型。此外，在2017年采集的水样中发现了非洲猪瘟病毒(ASFV)，这在中国首次报告非洲猪瘟（2018年）之前，还检测到甲型肝炎病毒(HAV)和肠道病毒71型(EV71)等RNA病毒，浓度分别在2020年4月和2018年4月达到峰值。HAV和EV71的动态与当地流行趋势一致。最后，基于毒力基因图谱，该研究确定了两个城市污水中的风险水平。这一工作流程说明了对当地流行病早期预警的可能性，有助于提前为当地的特定病原体做好准备。
研究方法
采样点：东港市大洋河(DY)和东沟(DG)，湛江城区(DA)和农业区(DB)
采样时间：2017-2020年间，每年采集两次水样（半年一次）
检测方法：MLST基因分型，微流控芯片筛选，病毒基因分型，宏基因组测序分析
实验流程：
图1.废水中新出现病原体风险评估的工作流程示意图。
工作流程包括潜在病原体的筛选、病原体基因分型和风险评估。
主要研究结果
1.东港水样中潜在致病菌的筛选
在宏基因组数据中，89.3%的reads被分配到细菌中。参考毒力因子数据库(VFDB)，使用MetaPhlAn2对每个样品进行分类鉴定以进一步研究潜在病原体。
在DY的宏基因组数据中大量检测到40种病原体，包括水传播致病菌和呼吸道致病菌。2019年后，鲍曼不动杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、肺炎克雷伯菌、肠沙门氏菌、结核分枝杆菌和空肠弯曲杆菌等几种检测到的病原体的相对丰度有所增加。相比之下，其他物种在2017年至2020年期间有所减少，例如韦罗尼气单胞菌、嗜肺气单胞菌和邦格里沙门氏菌(图2B)，随后培养实验，检测出其中32种细菌。
在DY数据中，城市污水中的细菌组成在2017年至2018年期间保持稳定(图4)。此后，变形杆菌的相对丰度在2019年4月至2019年下降到17.3%，但在2020年9月后成为优势类群。宏基因组数据中共检测到76种细菌病原体，其中32种用于可视化(图2D)。致病性不动杆菌属在2018年和2020年达到了较高的相对丰度，所有致病性弧菌都在2019年10月达到顶峰，其他病原体的相对丰度没有明显的波动。在32个选定的细菌病原菌中，在不同采样时间的培养检测中获得17种(图2D)。在研究期间，结核分枝杆菌、梅毒螺旋体和肠炎沙门氏菌的相对丰度保持不变，它们分别是结核病、梅毒和伤寒/副伤寒的临床病原体。
图2. 东港市农业(DY)和城市污水(DG)采样点细菌群落2017-2020年动态
A：DY细菌群落相对丰度；B：DG中细菌群落相对丰度；C：DY样品中细菌病原体的动态；D：DG样品中细菌病原体的动态
2.东港地区细菌病原菌基因分型
对单个菌种进行MLST基因分型，以确定是否属于致病基因型。共分离出16种细菌进行MLST，东港地区霍乱弧菌和副溶血性弧菌分别鉴定出3个和5个序列类型（STs），其中仅副溶血性弧菌ST3在当地临床中被确认。7个肺炎克雷伯菌STs（包含ST11和ST23）被发现，并且在当地医院相关感染中占主导地位。检出5株嗜肺链球菌，但未检出临床病例，临床和环境标本中均检出北京分支(ST4)结核分枝杆菌，环境中的肠链球菌ST34和ST19在当地患者中被检出。对于其他病原体，除阴沟肠杆菌外，每种都检测到6种STs，且至少有一种STs出现在临床中。虽然一些致病基因型在当地的临床样本中没有被鉴定出来，但它们是普遍存在的，如金黄色葡萄球菌ST7，因此仍需要进一步的研究。
3.东港水样中致病病毒的筛选
选择了60种与公共卫生风险相关的致病病毒，其中，通过将宏基因组reads比对到参考基因组确认了20种DNA病毒，用微流控芯片对40种RNA病毒进行了筛选，最后通过qPCR检测确认。
在DY发现了非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪痘病毒(Swinpox Virus)等几种病毒。ASFV在2017年10月被检测到，并在2018年达到顶峰(图6A)，并通过qPCR证实。qPCR在2018年4月后连续检测到ASFV，其中2018年4月的病毒载量为3.0×103拷贝/L。在DG地点未检测到ASFV和Swinpox病毒，在两个地点均未检测到其它人畜共患病DNA病毒。通过高通量微流控芯片检测检测了40种致病性RNA病毒的存在。DY样品中，经qPCR确认，2019年仅检测到诺如病毒、流行性腮腺炎病毒、鼻病毒和Human herpesvirus 6病毒。DG样品中，2017年至2019年在样本中检测到human enterovirus 71 (EV71)，2020年4月检测到Coxsackievirus 16 (CA16)。
4.东港水样中病毒基因分型研究
对阳性样本进行病毒基因分型，使用浓缩的DNA样本对DY 2017和2018年水样中ASFV B646L基因进行PCR扩增。从DY和其他国家的32个ASFV B646L序列数据中检测到的B646L的系统发育分析表明，前者与从辽宁和其他东欧国家的死猪中获得的第一个ASFV分离物(CN201801/2018) 在基因上是相同的。对东港市手足口病流行时2019年4月达到峰值(5.8×102拷贝/L)的EV71浓度进行了定量检测(图3B)，其中EV71的VP1基因PCR为阳性，系统发育分析证实东港EV71属于在辽宁省流行的C4a型，但PCR未扩增出CA16基因片段。在DG样品中，通过qPCR检测，从2018年10月连续检出了甲型肝炎病毒(HAV)，峰值在2020年4月(4.7×103拷贝/L)(图5C)，这与甲型肝炎病例大幅增加的时间吻合。进一步通过PCR扩增得到甲型肝炎病毒VP3/P2A区，对100个公开提供的甲型肝炎病毒基因组系统发育分析，发现DG中甲型肝炎病毒与大连分离株DL3(图5C)有遗传关系。其余阳性检测的病毒可能是由于病毒丰度低所致未被常规PCR扩增出。
图3.代表病毒的动态变化和系统发育关系。
5.湛江水样中潜在致病菌的筛选
宏基因组数据中大约90%的reads与细菌相对应。DA样品中，变形菌门数量最多，其次是疣微菌门和放线菌(分别为35%和58%)(图4A)。DB样品中，变形菌门从2017年的50.1%增加到2020年的84.7%(图4A)。两个地点的微生物组成自2018年11月后出现了差异。在每个采样时间，丰度 top20属代表了微生物群落的35%到57%(图5B)。在2019年(5.8%)和2020年(4.8%)采集的样品中发现了弧菌属(Arcobacter)，而气单胞菌属(Aeromonas)和弧菌属(Vibrio Spp)在2017年11月达到峰值(分别为0.43%和4.1%)，在DA中还检测到其它几种细菌病原体(图5C)，所有时间均检出假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis），2018年5月达到峰值(0.00013%)，其他菌种也达到峰值，如不动杆菌属、肺炎克雷伯菌属等。基于培养的分析证实，DA和DB位点分别存在22种和18种致病物种(图5C，D)。对两个城市的宏基因组数据进行直接分类。每个数据集中的宏基因组组装基因组(MAG)数量从7到23个不等，相对丰度在0.215%到1.325%之间。然而，对MAGs的注释结果表明，它们都不含有毒力因子，说明该方法只能检测高丰度的病原体。
图4.湛江地区细菌群落动态研究
6.湛江水样细菌病原菌基因分型
在DA和DB中分别鉴定出4种和13种副溶血性弧菌的序列类型 (sequence types，STs)。在10份湛江样品中有3份分离到ST1740和ST1799。湛江城区共分离到4株霍乱弧菌STs(ST69、ST1170、ST1171和1株新的STs)，其中ST69属于O1大流行血清群。在城市和农业样品中均检出肺炎克雷伯菌ST23、ST35和ST86。城区样品中检出三株流行基因型ST11、ST34和ST13沙门氏菌，并出现在广东省临床样品中。
7.湛江水样中病毒的检测和基因分型
湛江宏基因组数据中3.2%的reads分类为DNA病毒序列，其中97.8%对应细菌噬菌体。2017年和2019年还检测到四种人类病原体，其中包括与儿童腹泻有关的Tanapox病毒。2018年5月后，湛江也检测到低丰度的猴痘病毒和Human herpesvirus 6，2019年5月，检测到很低(0.001%)的Swinpox病毒，可能由于其低丰度然而，qPCR检测未检测到上述病毒。对于RNA病毒，使用微流控芯片和qPCR技术在2018年11月、2019年5月和11月湛江样品中检测出诺如病毒，载量分别为3.4×104、1.78×103和2.9×103拷贝/L，2018年11月检测到猪札幌病毒(Sapovirus)，为3.2×103拷贝/L，但常规PCR没有扩增出这些病毒的DNA片段。
8.机会性病原体丰度定量和WGS
两个城市的样品宏基因组数据中给定病原体在多个点的相对丰度显著增加。例如，2018年4月，DG样本中A. baumannii, Acinetobacter lwoffi和 Acinetobacter junii增加了100倍以上，2018年10月，DY样本中发现培养基Aeromonas media增加了10倍以上(图2)。东港水样的qPCR检测表明，污水中病原菌丰度在7.1×104~1.33×109拷贝/L之间。2018年4月和2020年4月，A. junii, A. baumannii和A. lowffii三种细菌在DG中的丰度超过了半数致死量（LD50）水平。
从湛江样品中选择了4株无MLST方案的病原菌，A. junii , V.alginolyticus, S. algae 和A. hemolyticus进行全基因组测序（WGS）。结果表明，V. alginolyticus与本地水产养殖场的菌株有亲缘关系，表明它们是该地区特有的(图5A)。S. algae ZJ61与我国山东的4株临床分离株有亲缘关系，而S. algae ZJ-SH在一个独立的分支上(图6B)。结合75个A. junii基因组进行系统发育分析，2018年东港水样分离株JZ20与2020分离株JZ102(图6C)聚为一类。对57个A. hemolyticus基因组分析，湛江分离株ZJ54与从医院分离的SZ3452有亲缘关系(图6D)，分离株HK30与医院的菌株XH900聚在一起。
图5.根据Vibrio alginolyticus (A)Shewanella algae (B) Acinetobacter junii (C) Acinetobacter haemolyticus (D)核心基因组序列，
用最大似然法构建系统发育树本研究中获得的分离株用星号表示
9.污水样本的公共卫生风险评估
细菌：低风险，在宏基因组数据中可以检测到病原体，但不能培养；中风险，宏基因组数据中检索到病原体及其关键毒力基因，但没有分离到致病基因型；高风险，在随后的分离和MLST能确认致病基因型。病毒：中风险，qPCR/微流控芯片/宏基因组数据检测到；高风险，用传统的PCR可进一步扩增。
对两个城市采样地点的公共卫生风险进行了评估，通过与VFDB数据库比对，确定了95种参考病原体。主要毒力因子包括(1)毒素，(2)鞭毛和菌毛，(3)脂多糖和抗原，(4)致病岛。
24个物种含有关键的毒力因子，这些因子在不同的水样中情况不同，因此城市和农业水样有不同的健康风险特征。2020年4月收集的东港城市污水总体健康风险最高(图6A)，包含1种病毒病原体高风险和6种细菌病原体高风险。2019年至2020年，报告的甲型肝炎病例有所上升，同时甲型肝炎病毒的在样品中浓度很高。从2017年-2020年病例数增加数量（183-622例）和病毒检测量（增加10倍）不一致，可能是因为城市临床监测还没建立起来，无症状或未被识别的患者未被报告，这突显了环境监测的重要性。此外，农业污水中ASFV、蜡状芽孢杆菌和肠球菌有高风险，需要干预以保证食品安全。
湛江水样结果表明A. baumanni, B. cereus, C. jejuni, E. coli, K. pneumoniae, S. enterica, S. sonii, S. pneumoniae和V. cholerae在城市地区具有很高的健康风险(图6B)。其中，2018年5月采集的废水中含有7种高风险病原体，Aeromonas sp., B. cereus和V. parahaemolyticus是农业污水的主要关注对象，湛江的城市和农业废水中没有发现高风险病毒病原体。
图6.东港(A)和湛江(B)污水样品中细菌和病毒病原体的公共卫生风险评价
蓝色：低健康风险；灰色：中等健康风险；红色：高健康风险
总结
该研究提出了一种同时检测多种毒力基因的污水公共健康风险评估框架，该框架具有很大的病原体环境监测应用潜力。废水监测是可视化病原体动态和提供病原体与疾病之间关系的重要洞察力的有力平台。在农村，临床监测或报告系统不够充分，这一风险评估工具还可以监测农村地区病原体的流行病学。
该篇论文运用了百迈客云分析平台进行宏基因数据分析，如您有任何疑问，可以讨论区留言或者发邮件给我们（邮箱地址：tech&@biomarker.com.cn)
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