分类: 微生物组测序

微生物多组学研究分析已经在众多疾病中发挥着越来越重要的作用,百迈客目前不仅提供二代微生物检测,还提供三代微生物检测,并且已经成功将微生物与其他组学联合分析。

今天想跟大家谈一谈肠道微生物研究中的多组学分析思路。我们来看看百迈客成功案例是如何将通过代谢组学和微生物多样性多组学揭示中医药葛根素在非酒精性脂肪性肝(NASH)的应用。

广州中医药大学药学院、 广东药科大学中医学院、中山大学附属第六医院联合在Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis杂志发表以“Therapeutic potential of puerarin against methionine-choline-defificient diet-induced non-alcoholic steatohepatitis determined by combination of 1H NMR spectroscopy-based metabonomics and 16S rRNA gene sequencing”为题的文章,揭示葛根素对非酒精性脂肪性肝炎的治疗方向的相关研发现,从而为非酒精性脂肪性肝病的治疗提出新的见解理论基础。其中微生物多样性检测由百迈客协助完成。

中文题目:代谢组学和微生物多样性联合测定葛根素对蛋氨酸胆碱缺乏膳食诱导的非酒精性脂肪性肝炎的治疗潜力

期刊杂志:Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

影响因子:IF=4.0

发表时间:2021年4月15日

原文链接:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33601157/

研究背景

先前发表的研究揭示了葛根素对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的保护作用,但该作用的确切机制仍不清楚。现在的工作是尝试通过使用代谢组学和16S rRNA基因测序技术(微生物多样性检测)的组合来评估葛根素对 C57BL/6 小鼠蛋氨酸胆碱缺乏 (MCD) 饮食诱导的 NASH 的有益作用和潜在机制。基于核磁共振 (NMR) 的代谢组学在 MCD 饮食喂养的小鼠和健康对照。在小鼠肝脏组织和尿液中,总共有 8 种和 13 种代谢物被鉴定为与 NASH 相关的差异代谢物。富集的途径主要是包括嘧啶代谢、一碳代谢、氨基酸代谢、糖酵解、三羧酸(TCA)循环和酮体的合成和降解。此外,微生物多样性测序分析描绘了响应 MCD 饮食的肠道微生物群谱的显着变化,在小鼠中发现了 40 种与 NASH 相关的差异细菌分类群团体。葛根素可部分改善NASH小鼠的肝脂肪变性和炎症代谢紊乱和重新平衡肠道菌群。具体来说,葛根素可以抑制脂多糖(LPS) 产螺杆菌属,并促进产丁酸盐的 Roseburia 属。这些发现为深入了解 NASH 的发病机制提供了新的见解,并提供了进一步的葛根素作为抗 NASH 药物的潜在用途的证据。

实验材料与方法

材料:

八周龄雄性 C57BL/6 小鼠,驯化 1 周后,将动物随机分为三组(n = 6每组):

对照组喂食甲硫氨酸 – 胆碱充足(MCS)饮食(Dyets,Inc.,Bethlehem,Pennsylvania)4周;

模型组喂食MCD饮食(Dyets, Inc., Bethélehem, Pennsylvania)4周;

葛根素组喂食MCD 饮食并与葛根素同时灌胃给药(0.2 g/kg,悬浮在 0.5% 羧甲基纤维素钠中)每天一次,持续 4 周,

取小鼠的尿液、粪便、肝组织作为检测样本;

方法:

代谢组分析,微生物多样性检测,血清和肝组织生化测定

研究结果

1. 葛根素治疗可改善MCD饲料喂养小鼠的肝脂肪变性和炎症

如图1A-C所示,4周MCD喂养小鼠后,小鼠体重和肝脏体重显著下降。葛根素治疗可显著减轻体重损失,但对肝脏重量没有影响。但3个试验组的肝/体质量比无显著差异。ALT和AST通常用于评估肝细胞损伤。与对照组相比,NASH模型组血清ALT、AST活性显著升高,TG、TC明显降低。葛根素补充消除了血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高,但对血清中TC和TG没有影响(图1D G)。在MCD饮食诱导的NASH小鼠中,观察到肝脏TG含量显著升高,而葛根素治疗则阻止了这种积累。肝TC含量各组间无差异(图1H I)。MCD饲料喂养的模型小鼠与正常小鼠相比,肝切片的H&E和 Oil Red O染色显示,肝切片出现微泡和大泡性脂肪变性,并伴有炎症细胞浸润和肝细胞球化。

图1. 葛根素治疗或不治疗MCD日粮喂养C57BL/6小鼠4周的特征

葛根素处理的小鼠表现出肝细胞中的脂肪沉积、炎症和气球样变明显减少(图 2)。本文的结果表明葛根素可以对小鼠 MCD 饮食诱导的 NASH 的有益影响。

图2. 葛根素改善MCD饮食诱导的NASH小鼠肝脏组织学

2. 葛根素治疗可减轻MCD饮食喂养小鼠的代谢紊乱

图3A和图4a显示了小鼠肝脏组织和尿液的代表性1H NMR谱图。为了研究NASH对小鼠代谢紊乱的影响,基于小鼠肝组织和尿液样本的归一化核磁共振波谱数据,计算PCA和OPLS-DA模型,揭示葛根素的干预作用。观察到对照组和模型组之间肝脏和尿代谢表型的清晰分离(图3B, 4b和S1),表明MCD饮食诱导小鼠NASH后发生了一些显著的生化变化。此外,PCA 和 OPLS-DA 得分图揭示肝脏和泌尿代谢的完全分化模型和葛根素组之间的概况以及显示葛根素组有恢复到健康对照组的趋势,这可能归因于葛根素对NASH的治疗效果。两个模型参数R2Y 和 Q2 以及置换测试的结果说明了OPLS-DA 模型的有效性(图 3C 和 4C)。


图3  肝脏代谢组学分析
图4. 尿液代谢组学分析

基于来自 OPLS-DA 模型的 VIP 值(VIP ≥ 1)和来自单变量统计分析的 P 值 (P < 0.05),8 和 13显着改变与 NASH 相关的内源性代谢物是分别被鉴定为肝组织和尿液中的潜在生物标志物(图 5A 和 B,以及表 1)。肝脏代谢特征NASH 模型小鼠的 w-6 脂肪酸水平升高,谷氨酰胺、丙酮酸、琥珀酸、谷胱甘肽/GSSG、尿苷和尿嘧啶,连同的磷脂酰乙醇胺水平降低。关于健康控制与对照组相比,模型组尿中n -乙酰糖蛋白(NAG)、丙酮酸、2-氧戊二酸、肌氨酸、苯乙酰甘氨酸、乳酸水平升高,丙氨酸、赖氨酸、丙酮、乙酰乙酸、牛磺酸、甜菜碱、肌酐水平降低。此外,除了肝脏组织中的谷氨酰胺、丙酮酸和磷脂酰乙醇胺(PE)以及尿液中的丙氨酸和苯乙酰甘氨酸外,所有与NASH相关的潜在生物标志物均被葛根素显著逆转。

代谢途径分析与MetaboAnalyst来探索MCD饮食诱导小鼠NASH最相关的途径。根据大于0.1的影响值,发现被干扰的代谢途径(图5C和6)主要包括酮体的合成和降解、牛磺酸和次牛磺酸代谢、丙酮酸代谢、谷胱甘肽代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,丁酸代谢和糖酵解/糖异生。这些途径表明它们具有作为葛根素抗NASH的靶向途径的潜力。

图5. 与NASH相关的差异代谢物功能富集分析

3. 葛根素处理可调节MCD饲粮小鼠肠道菌群组成

文中通过对18个MCD 饮食喂养的小鼠肠道内容物进行微生物多样性测序(16s rDNA V3+V4),总共产生了 1,358,128 个原始序列,质控过滤后总共鉴定 856,180 个序列(每个样本的读数为 47,565 ± 7749)。然后将相似度为 97%的高质量序列划分为333 个 OTU。稀有与香农指标分析表明,测序深度罕见的覆盖了新类型和大部分微生物多样性(图 7A)。根据ACE、Chao1、Shannon和Simpson指数,三组间alpha多样性无显著差异。然而,未加权的 UniFrac PCoA 显示小鼠的整体肠道菌群微生物群组成结构发生了明显变化,给予葛根素重塑了NASH小鼠的菌群组成。

图6. 小鼠粪便微生物组16S rRNA基因测序分析

门水平的分类分析表明,厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门在所有类群的粪便微生物群落中占优势。与对照组相比,模型组的Epsilonbacteraeota水平较高,而葛根素处理可逆转这一趋势(图7D)。采用LEfSe方法,筛选出LDA评分大于2.0的明显改变的类群,以鉴定类群间(门到属)的差异类群。如图8和图9所示,在对照组和模型组之间,模型和葛根素组之间,共发现了40和24个不同的细菌分类分支。有趣的是,在葛根素治疗后,14种不同的细菌类群在NASH小鼠中显示出相同的恢复正常水平的趋势,包括p Epsilonbacteraeota, c Campylobacteria、o弯曲菌目、 f 螺杆菌科、 g幽门螺杆菌属、p 脱铁杆菌门、c 脱铁杆菌、 o 脱铁杆菌、 f 脱铁杆菌科、g Mucispirillum、o Betaproteobacteriales、f burkholderaceae、g Parasutterella 和g瘤胃球菌科NK4A214组。值得一提的是,模型小鼠中氏菌属的成员比对照组小鼠大,葛根素治疗后进一步扩大。(字母 p、c、o、f 和 g 分别代表门、纲、目、科和属)

图7. 计算配对组间差异分类支系的LEfSe LDA评分直方图

图8. 分类树配对组间细菌分类差异的LEfSe分支图

4.MCD喂养小鼠肠道菌群与代谢表型的相关性

为了探索肠道微生物组和代谢组之间可能的功能关系,作者在属水平上对差异细菌类群和与NASH相关的差异肝脏和尿液代谢物进行Pearson相关性分析(图10)。作为脂多糖(LPS)的产生菌,幽门螺杆菌属在模型组中富集,与模型组混合尿糖蛋白中复合n -乙酰基信号的增加呈强正相关,这与急性期炎症反应有关。

图9. 小鼠肠道菌群在属水平上的紊乱以及肝脏和尿液代谢产物的改变之间的相关性

文章总结

以NMR为基础的代谢组学和微生物多样性多组学相结合,评价葛根素在MCD饲养小鼠中的抗NASH活性。研究结果表明,葛根素可以通过改善与NASH相关的代谢紊乱和重新平衡肠道菌群来改善小鼠的肝脂肪变性和炎症。这些结果为葛根素对MCD饮食诱导的NASH的肝保护作用提供了重要的机制见解。

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参考文献:

Gong MJ, Zhu CY, Zou ZJ, et al. Therapeutic potential of puerarin against methionine-choline-deficient diet-induced non-alcoholic steatohepatitis determined by combination of 1H NMR spectroscopy-based metabonomics and 16S rRNA gene sequencing. J Pharm Biomed Anal. 2021 Apr 15;197:113964. doi: 10.1016/j.jpba.2021.113964.

文献下载:
https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33601157

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