蔬菜基因定位的方法

表型调查：

分别2014、2015和2017年种植亲本、F1及DH群体，2次田间重复，每个重复种植3株；由于2014年环境影响表型数据缺失度较高，如果用这个数据可能影响QTL定位分析，因此，后续作者利用BLUE分析来解决这种由于多年表型数据偏差，使得3年数据均得到利用。因空心茎这个表型调查比较困难，所以只简单的分为空心茎和非空心茎2种类型。

方法：SLAF测序，HighMap构建遗传图谱，IciMapping进行QTL定位，MapQTL进行BLUE分析及QTL定位

1、SLAF遗传图谱

测序数据与 TO1000基因组进行比对，比对率为75.99%，有24.01%是没有比对上的，比对率较低主要是可能由于2种原因导致——基因组差异和结构变异。因为西兰花和甘蓝型TO1000是2个品种，由此可见一个物种中一个品种的基因组并不能包含这个物种所有的信息。

开发了185,349个SLAF标记，其中，20,250个SLAF标记可以成功分型，最终上图的标记为4787个，分布于9个LG中，构建一张平均图距为0.22cM的遗传图谱（如下图），标记间最大gap超过10cM，这可能是由于小孢子培养构建DH群体的过程中，可能某种基因型更容易形成胚胎和再生植株，从而产生偏分离或某段染色体区域中无个体发生重组。

图2 西兰花遗传图谱

2、QTL定位

利用3年表型数据定位到8个相关位点，其中QHS.C09-1的表型变异率为15.6%（叮咚——有主效位点了，盘它），其余位点均为小于10%。还有上面的小助手BLUE也帮助找到了一个位点QHS.C09-2，其表型变异率为14.1%。其中QHS.C09-1和QHS.C09-2存在部分重叠，因此认为QHS.C09-2也是与空心茎相关的主效QTL。

图3 QTL定位结果

图4 BLUE分析结果

开发了406,563个SLAF标签，171,413个是为多态的，其中94,733个SLAF标签可成功分型，最终构建了含有9,038 个标记的遗传图谱，12个LGs，总图距为1,586.78 cM，平均图距为0.18 cM。基因组与遗传图谱共线性均≥0.9。

2、QTL定位

双亲、F1及F2:3家系，3年3个环境下的表型调查，发现双亲均为极端类型，而F1和F2:3家系均趋向于中亲类型，认为花期和单节花数为数量性状。利用R/QTL定位到6个QTL，3个与花期相关，3个与单节花数相关。他们分别能够解释46.35-50.37%和99.13-99.76%的花期和单节花数的表型变异。利用QTL.gCIMapping.GUI定位到了2个与单节花数相关的新微效QTL。

3、候选基因预测

花期相关基因：针对主效QTL——Ft2.1进行重点分析，它处于遗传图谱上的区间为0.763cM，对应的Zunla-1基因组上物理区间为210Kb，包含25个基因，其中存在之前鉴定到的Capana02g000700基因，编码花器官同源异型蛋白。进化分析表明Capana02g000700的同源基因，金鱼草LIP1和LIP2、拟南芥APETALA2和辣椒CaAP2，均在花器官发育阶段存在重要作用。同时，比对双亲间序列差异，发现8个SNP标记和1个6bp的InDel标记，这导致亲本CA1存在2个氨基酸的缺失和5个氨基酸的改变。继DNA层面分析之后，RNA层面的分析qRT-PCR和RNA-seq表明，这个基因在双亲间存在差异表达，且在花器官中表达量最高，最终认为Capana02g000700就是控制花期的候选基因。

单节花数相关基因：主效QTL——Mf2.1，它处于遗传图谱上的区间为0.382cM，对应的Zunla-1基因组上物理区间为1400Kb，包含98个基因。单节花数是基于芽尖的分生组织变化产生的差异，已由报道表明营养生长转变为生殖生长过程中，产生明显表达差异的为转录因子（TF）。且Mf2.1定位区间内也包含很多TFs。结合已报道的中间营养分生组织、过渡分生组织和成花分生组织的转录组数据，发现在过渡分生组织中多数基因表达是上调，其中包含不同家族的TF，因此将这些上调的TF作为控制单节花数的候选基因。

图6 主效QTLFt2.1的局部连锁图和基因表达分析

4、基因共表达分析

WGCNA（加权基因共表达网络分析），是一种分析多个样本表达模式的分析方法。该分析方法旨在寻找协同表达的基因模块(module)，并探索基因模块与关注的表型之间的关联关系，以及网络中的核心基因。

利用之前研究的不同发育阶段和不同组织部的WGCNA分析结果，找到了花器官发育特定模块，其中包含107个基因。这些基因中10个为TFs，其中就包含已鉴定的Capana02g000700，这表明这些TFs可能与花发育的转录调控相关。这107个基因中，发现9个基因与Capana02g000700高度共表达，分为3个家族，且其功能均与花发育相关。上述，均表明Capana02g000700通过抑制靶基因和/或TF表达来控制花器官发育，进而影响花期。

图7 基因共表达网络分析

1. 利用F2:3家系对F2群体表型进行多年考查；
2. 利用BLUE分析解决当不同年份的环境变化大的问题；
3. 利用WGCNA找到目标性状调控网络和其中的核心基因。