近日，国外科学家团队在eBioMedicine发表论文，题为“Spatially resolved T cell receptor diversity mapping uncovers variability of the cancer immune microenvironment”。
该研究首次基于Xenium原位测序平台开发了定制化TCR检测面板，实现了单细胞水平的TCRα/β可变链配对空间定位，为肿瘤免疫研究提供了革命性工具。
研究背景
肿瘤浸润淋巴细胞是肿瘤微环境的重要组成因素，影响成功抗肿瘤免疫应答的诱导。近年来，研究集中于探讨实体瘤、其周围组织以及外周血的TCR谱系如何与疾病进展和治疗效果（特别是免疫治疗）相关联。在转移性三阴性乳腺癌中，研究表明TCR谱系随癌症进展逐渐丧失多样性，导致趋同演化为相似克隆型，同时伴随肿瘤免疫逃逸机制的出现，而外周血T细胞仍保留了一定的细胞毒性潜力。在非小细胞肺癌中，新辅助免疫治疗后的治疗后分析显示，主要病理缓解患者的肿瘤床富集了治疗期间在外周扩增的T细胞克隆。然而，由于TCR谱系对疾病结局的影响似乎因癌症类型而异，TCR多样性的详细分析对于理解癌症进展和优化治疗策略至关重要。
研究结果
TCR基因panel设计及NSCLC中的TCR与T细胞分布
作者首先根据鉴定的TCR恒定区和可变区的靶序列来设计TCR基因panel，并与Xenium pan-tissue联合使用。为鉴定TCR分布模式及其与NSCLC组织中T细胞亚群的空间关系，研究人员使用Lymphotrack、RNA-seq、ISS和Xenium多种方法交叉验证一例已知克隆性的腺癌（AC）病例和一例鳞状细胞肺癌（SqCC）病例，以及相应的未受累淋巴结样本中的TRBV基因，发现整体谱系大体一致，反映了样本的生物学特性。
Leiden聚类后的细胞分型揭示了AC和SqCC样本中共36个细胞亚型。值得注意的是，两个肿瘤的免疫细胞谱存在差异，AC显示CD8 T细胞占显著优势，而SqCC样本中活化CD4+T细胞和三级淋巴结构（TLS）相关CD4+T细胞更为丰富。组织学上，SqCC病例显示癌症与基质区域之间明显的分区，这是该亚型的典型特征；CD4和TLS相关CD4+T细胞定位于基质区。相比之下，AC病例显示肿瘤区CD8+T细胞高度浸润，而CD4和TLS相关CD4+T细胞位于肿瘤-基质边缘，与浆细胞/B细胞紧密相邻。
为了首先概述TCR分布并确认同一组织区域中α和β V基因的同时存在，作者使用一种分箱方法评估TCR α和β可变基因的密度和多样性。在SqCC中，富含CD4和TLS相关CD4+T细胞的区域比位于更靠近癌症区且显示较低TCRV多样性的CD8+T细胞丰富六边形表现出更高的TCRV多样性。AC以CD8浸润为主，总体上显示较低的TCR多样性。通常，TRBV和TRAV基因遵循相似的分布模式，尽管TRAV基因在两种组织学亚型中均表现出更高的多样性。
图1
优势TCRVβ/Vα对定位于肿瘤细胞附近
作者开发了TCR克隆分型流程，用于为单个T细胞分配推定克隆型，并进一步评估了AC和SqCC活检以及相应未受累淋巴结中独特TCRVβ/Vα对的数量。两个样本的总TCRVβ/Vα对计数相似，SqCC中检测到681个TCRVβ/Vα对，AC中检测到688个。相比之下，淋巴结显示更高的多样性，SqCC配对淋巴结有1164个TCRVβ/Vα对，AC配对淋巴结有1153个TCRVβ/Vα对。这一发现强调了淋巴组织中更大的T细胞多样性。此外，淋巴结内最优势的TCRVβ/Vα对占SqCC（TRAV4|TRBV20-1）配对淋巴结总对数的0.64%和AC（TRAV26-1|TRBV20-1）的0.94%。然而，在原发性肿瘤中，最优势的TCRVβ/Vα对（SqCC：TRAV26-1|TRBV20-1，AC：TRAV29/DV5|TRBV30）分别占SqCC的2.1%和AC的12.2%，突出了肿瘤部位TCR的选择性。值得注意的是，AC原发性肿瘤中最优势的TCRVβ/Vα对在配对淋巴结的前400个TCRVβ/Vα对中不存在。
作者接下来探索了AC组织中优势TCRVβ/Vα对的位置，邻域分析显示优势T细胞靠近癌细胞。
T细胞亚群及其TCRVβ/Vα对的组织分布
作者首次按对AC和SqCC中的T细胞亚群进行鉴定，随后评估特定T细胞亚型的所有TCRVβ/Vα对（而非仅优势TCRVβ/Vα对）是否在相似细胞邻域中关联，结果发现，在SqCC样本中也观察到类似趋势，该样本富含活化CD4+T细胞以及TLS相关CD4+T细胞，它们也构成了鉴定的大多数TCRVβ/Vα对。与AC病例相似，活化CD4+T细胞和TLS相关CD4+T细胞靠近其他免疫和基质细胞。CD8+T细胞与SqCC癌细胞无空间接近关系，这反映了活检中CD8+T细胞浸润程度低。CD4+T细胞亚群共享TCRVβ/Vα对并保持高多样性，而CD8+T细胞亚群与CD4+T细胞相比多样性较低且具有不同的TCRVβ/Vα对。
图2
T细胞富集空间域的表征
作者使用BANKSY算法鉴定空间域，鉴定了空间域2，涵盖25个区域，主要由活化CD4/TLS相关CD4+T细胞组成，其组成类似于TLS结构。空间域2的区域富集CD4+T细胞标志物（TRBC1、TRAC、CD3、CD4、CXCR4），中度富集B细胞和浆细胞标志物（CD19、MS4A1、CD79A）。树突状细胞和巨噬细胞标志物（GPR183、CD86、CD68）以及CD8a和早期T细胞活化和耗竭标志物（CCL5、GZMB、LAG3、HAVCR2、PDCD1、CTLA4）的表达较低。同时，平均基尼指数为0.28，表明这些聚类中TCR基因的高多样性。这些发现提示未成熟TLS样结构的形成。
图3
乳腺癌TCR谱系的时空监测
作者对ER+/HER2-早期乳腺癌患者FFPE针吸活检样本（包括基线和治疗中）也进行TCRVβ/Vα对鉴定。发现基于基尼指数的T细胞受体多样性在基线和治疗中时间点之间以及T细胞亚型之间存在差异。无应答者显示治疗中TCR多样性降低，主要由CD8+T细胞驱动，而应答者未观察到显著变化，提示无应答者治疗过程中可能存在非功能性或耗竭T细胞扩增。此外，还观察到基线和治疗中时间点之间维持的TCRVβ/Vα对重叠程度存在差异，但在6例患者中的5例，基线发现的最丰富TCRVβ/Vα对在治疗中得以维持。
图4
研究总结
该研究通过设计互补TCR探针panel结合Xenium技术，实现了非小细胞肺癌（NSCLC）和乳腺癌诊断组织样本中的TCR基因序列的空间定位，鉴定了TCR α（TRAV）和β（TRBV）可变基因对（TCRVβ/Vα对），为高通量空间评估TCR多样性及单细胞分辨率转录组分析提供了一种高度灵活且有价值的工具。
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