叶霉病| 重测序BSA+KASP策略定位番茄抗病基因Cf-10

叶霉病，一种由番茄叶霉病菌引起的番茄病害，严重威胁着全球番茄的生产，并导致每年数百万美元的经济损失；然而，番茄叶霉病菌抗性基因定位结合MAS策略是改良番茄抗病能力的一条有效途径。截至目前，利用不同的遗传材料已经定位到许多番茄叶霉病菌基因或QTLs，但对于Cf-10基因定位的研究未见报道。

而本研究便集中于考察Cf-10抗病性的遗传基础，即运用一种新的组合分析策略（重测序BSA：SNP-index与InDel-index共定位，结合KASP分型精细定位，图1.）快速定位抗病基因Cf-10。首先，根据F1，F2与BC1F1抗/感病表型证明番茄叶霉病菌抗性受显性单基因控制；通过对F2群体的抗/感病池重测序，并联合运用SNP-index与InDel-index的分析方法将Cf-10共定位在Chr 1.上的3.29Mb区间。接着，利用在此区间开发出的KASP标记进行精细定位。随后，Cf-10的定位区间缩短到790 kb，其中只有一个候选基因Solyc01g007130.3，此基因注释为一个含有LRR基序的受体蛋白激酶。最后，通过RT-qPCR分析进一步验证Solyc01g007130.3为Cf-10候选基因。

图1. 快速精细定位基因新的组合策略

研究结果

为考察Cf-10的遗传基础，作者对品种Ontario 792，Moneymaker及其F1，F2与BC1F1群体的抗病能力进行评估。结果显示，品种Moneymaker对10种病菌生理小种表现敏感，而Ontario792均表现显著抗病能力，暗示Ontario792对番茄叶霉病菌具有广谱抗病能力；所有F1代个体均表现抗病，F2代抗病与感病个体呈现3:1分离比，暗示Cf-10受显性单基因控制，并且BC1F1的表型分离比验证了这一结果（图2.）。

图2. 番茄叶片表型及其分离模式

      为定位抗病基因Cf-10，作者采用BSA重测序结合SNP-index与InDel-index分析的方法进行共定位。通过对双亲及2个极端混池高通量测序并分析发现4个样品间共有159,740个SNPs与74,988个InDels（图3.A与B）。接着，利用SNP-index与InDel-index两种方法定位Cf-10抗病QTLs，如图3（C与D）所示，仅定位到1个QTL，并且这两种关联算法均将这个QTL锚定在Chr.1；不同的是，SNP-index定位区间为3.35Mb，而InDel-index为3.74Mb，二者共定位区间限定在3.29Mb。其中共有408个注释基因，包括73个非同义基因，16个移码基因与16个包含eLRR domain的基因。

图3. SNP/InDel统计及BSA分析. A. SNP统计；B. InDel统计；C. SNP-index分析；D. InDel-index分析

      由于3.29Mb区间仍包含大量基因，作者进一步开发出16个KASP标记，其中5个有效的KASP标记用于147个单株（141个来自F2，6个来自F1，Ontario792 与Moneymaker）的基因分型。对Ontario792，Moneymaker与F1群体的KASP分型结果与测序结果一致，暗示测序结果与KASP分型是可靠的。接着，利用遗传图谱及KASP标记将定位区间锁定在SNP1与SNP2之间（790kb，图4.）。幸运的是，这个区间只有一个注释基因Solyc01g007130.3，编码受体蛋白激酶TMK1，其中含有一个LRR基序，这是抗病基因的一般特征，暗示Solyc01g007130.3是Cf-10抗病候选基因。然而，基于重测序数据在两亲本间并没有发现Solyc01g007130.3中存在SNPs或InDels，进一步利用Sanger测序也没有发现序列间差异。尽管如此，这并不能排除亲本间存在甲基化修饰的差异，并且此基因上游启动子等调控序列可能也存在着变异。

图4. SNP/InDel结合KASP标记定位基因Cf-10

      因此，为了进一步验证上述定位结果，作者又通过RT-qPCR分析检测候选基因Solyc01g007130.3在受病菌侵染的两亲本间的表达量差异，结果显示，在抗病品种中此基因的表达量显著高于感病品种，而在未感病时表达量并无明显差异（图5.）。结合以上结果，可以得出结论：基因Solyc01g007130.3就是Cf-10可能的抗病候选基因。

图5. RT-qPCR分析候选基因Solyc01g007130.3的表达量（病菌侵染后）

研究结论

      本研究采取一种新的组合策略（图1.），即两步信息分析SNP-index与InDel-index共定位，结合KASP标记分型精细定位，快速定位到特定性状候选基因，为克隆Cf-10基因以及分子标记辅助育种提供一条强力有效的途径。

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参考文献：

Liu G, Zhao T, You X, Jiang J, Li J, Xu X. Molecular mapping of the Cf-10 gene by combining SNP/InDel-index and linkage analysis in tomato (Solanum lycopersicum). BMC Plant Biol. 2019 Jan 8;19(1):15.