草莓为什么这么甜？

代谢组学是目前用于作物改良的新兴技术之一。它使人们对复杂的生物过程网络有了一个全面的理解，这无疑有助于理解生物过程的复杂网络，可持续加快作物生产。代谢组学优势包括能够研究整个代谢物谱的变化，了解不同代谢物的作用和调节，从而导致增产、非生物和生物胁迫耐性、抗病性、种子组成和风味丰富。

代谢物的改变同时也影响个体表型的变化，因此，代谢物可以当做一种“微观”表型，并利用大量的分子标记对其进行QTL定位，我们称之为mQTL（metabolome Quantitative Trait Locus，代谢数量性状基因座）。

mQTL目前多应用于拟南芥、水稻、小麦、番茄[1-4]等蔬菜作物，近期图谱君在码文献的时候发现一篇今年刚发表的多年生草本果树mQTL案例，马上就想跟大家分享一下，主要内容就是利用草莓种内构建F1群体结合初级代谢产物以及品质性状的表型进行QTL和mQTL共定位，找到糖、酸和Vc候选基因。

 

研究背景

草莓是世界上最重要的软果作物之一，其品质在很大程度上取决于果实的成熟过程。在果实发育过程中，花托在生长素的的刺激下经历了分裂、膨胀和成熟阶段，从而积累了糖、有机酸和挥发物。因此，成熟草莓因其独特风味而受到高度重视，同时其也是糖、矿物质、维生素和抗氧化化合物的重要来源。

提高果实营养品质和感官品质是目前草莓育种计划的一个重要目标，本研究利用F1群体研究草莓果实初级代谢相关代谢性状的变异和遗传控制。

材料与方法

材料：八倍体草莓，“232”和“1392”进行种内杂交得到F1群体，每个亲本或F1分别种植6株（营养繁殖）

性状：2年表型（2013和2014年），初级代谢产物、维生素（L-AA）和关键果实品质性状（可溶性固形物SSC、可滴定酸TA以及PH）

表型测量：2013和2014年连续在春/秋中旬中同一天收获熟果，每行收20-25个完全成熟的果实并混成3次生物学重复，用GC-MS检测和半定量初级代谢产物

标记开发：DArT 测序开发的SNP和SSR标记，参考基因组为F. vesca v4.0.a1

图谱构建及QTL定位：JoinMap 4.1和MapQTL 5.0的rMQM算法

表达分析：qRT-PCR（2个亲本及10个子代）和RNA-seq（分别混合8个LAA高的个体和8个LAA低的个体，三次生物学重复）

代谢分析：双亲及F1群体果实中相对代谢物含量

结果与分析

1、表型分析

虽然利用Shapiro–Wilk 测验，所有代谢产物的表型分布并不都是正态分布，但是其在子代群体均呈现连续变异，表明其为数量性状。

2、代谢分析

对2013和2014年的层序聚类分析，发现F1群体变异范围超过双亲，且分为近似相等的3大类，分别为糖及糖衍生物（A类）、氨基酸（B类）和多种化合物（C类）。并将2年的代谢数据进行了相关性分析，发现2年中2个季节的极显著相关（P<0.05）

图1、代谢分析结果

3、mQTL定位

得到含有2089个标记，33条连锁群的遗传图谱，总长为2489 cM ，平均图距为1.34cM，其中33条连锁群对应草莓基因组的28条染色体。利用2007、2008和2009年的果实品质性状（SSC、L-AA和TA和PH）和2年代谢表型均值进行QTL定位和mQTL定位。47个性状定位到133个独有的QTL位点。

图2 QTL和mQTL定位结果

4、联合分析

糖相关QTL和mQTL结果联合分析，在LG V的13-26cM内找到同时控制蔗糖和棉子糖的位点（qSuc-V-4和 qRaf-V-4），位于草莓基因组chr5的1,822,882–7,927,246 bp，含有1097个基因。通过注释发现，12个与糖的生物合成、代谢或运输相关的基因。根据前人研究结果，选定7个基因用于qRT-PCR分析。qRT-PCR分析发现FvH4_5g03890基因表现出显著差异。

酸相关QTL和mQTL结果联合分析，在LG V的18.18-25.6cM内找到控制琥珀酸的QTL位点（qSa-V-4），通过注释找到FvH4_5g09730基因，但其表达无差异。但由于与糖定位结果存在交集，有可能是一因多效。

图3 表达分析结果

5、L-AA候选基因Mannose-6-P-isomerase

通过本实验之前的研究定位结果和mQTL定位结果联合，在LG V的38.6-48.8 cM上找到一个与L-AA相关的QTL位点qLAA-V-1，位于chr5的8,160,286-13,129,181 bp，含有732个基因，通过注释找到2个相关基因FvH4_5g20650和FvH4_5g21090（Mannose-6-P-isomerase）。利用F1的2个混样RNA结果验证FvH4_5g21090（FaM6PI1）为候选基因，并利用qRT-PCR验证进行了验证。

图4 表达分析结果

总结

本文利用F1群体构建遗传图谱，对50种初级代谢产物及主要果实品质性进行QTL和mQTL定位，联合分析分别锁定与控制糖、酸和L-AA相关的候选基因，然后利用RNA-seq和qRT-PCR进行候选基因的验证。其实看起来也比较简单，但是胜在表型的多样化及多年数据，其实存在困难的地方在于群体的代谢物测量，还有可测量代谢物的种类，有些物质的标准品还是很难弄到的，本文只测量了初级代谢物，如果也能测量次级代谢物那就更好了，多维度考查表型，从而揭示某一个性状的调控机制已成为目前主流手段。

 

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参考文献：

1. Lisec J , Meyer R C , Steinfath M , et al. Identification of metabolic and biomass QTL in Arabidopsis thaliana, in a parallel analysis of RIL and IL populations[J]. Plant Journal, 2007, 53(6):960-972.

2. Matsuda F , Okazaki Y , Oikawa A , et al. Dissection of genotype–phenotype associations in rice grains using metabolome quantitative trait loci analysis[J]. The Plant journal : for cell and molecular biology, 2012, 70(4):624-636.

3.Detection of QTL for metabolic and agronomic traits in wheat with adjustments for variation at genetic loci that affect plant phenology[J]. Plant Science, 2015, 233:143-154.

4.Tieman D, Zhu G, Resende M F R, et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor[J]. Science, 2017, 355(6323): 391-394.

5.Vallarino J G, Pott D M, Cruz-Rus E,et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit[J].Horticulture Research,2019,6:4 

doi: 10.1038/s41438-018-0077-3

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