成功案例 | 百迈客助力草莓果色基因克隆

草莓枝叶和果实的颜色是由于液泡中的花青素积累形成的,但影响花青素积累的基因调控机制研究较少。近日,Journal of Experimental Botany在线发表了百迈客与华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室康春颖教授的合作文章,该研究以BSA混池测序的方法为基础对野生草莓种突变体进行分析,成功克隆到影响叶片和果实着色的RAP基因并对其功能进行验证,下面图谱君就为您带来该文章的解读。

文章题目:RAP codes for a GST anthocyanin transporter that is essential for the foliage and fruit coloration in strawberry

合作单位:华中农业大学

杂志:Journal of Experimental Botany

 

基因定位材料与方法

材料:

亲本YW5AF7(野生型)和rap(ENU突变体)

F2群体,27(野生表型)+18(突变表型)混池;

测序平台:Illumina HiSeq X Ten

关联方法:SNP index

验证方法:PCR扩增 + Sanger测序

 

结果分析

1. 表型鉴定

作者利用ENU诱变产生了绿色叶柄和叶片的突变体rap,相较与野生型YW5AF7,rap表皮细胞的色素沉着大大减少,叶柄的横截面脉管系统周围皮层细胞中显示出相同的变化,且与色素减少表型相一致的是rap叶片叶柄中总花青素含量显著降低(P <0.01),rap和YW5AF7对照果实中花青素含量都极低(图1)。通过对已知花青素合成途径相关基因表达及测序分析,RAP为一新基因参与花青素的积累,调控草莓的生长发育。

图1 表型鉴定

2. 基因定位

利用rap与YW5AF7杂交产生F2群体,突变体与野生型植物的比例接近1:3,说明rap由隐性单位点控制。应用BSA方法,将F2群体18株突变表型及27株野生表型植株植物全基因组重测序,在突变体和野生混池中分别获得43.3M和48.5M reads。共找到64个SNP位点与表型相关联。其中,在基因间区域有41个,内含子有11个,UTR有3个,编码序列有9个。作者重点关注了9个编码区的SNP差异(图2),其中8个位点导致同义突变或错义突变,仅一个SNP(C到T)导致基因31672的提前终止,通过PCR扩增和Sanger测序在50个F2 rap突变体中单独检测该SNP,所有个体都均表现出纯合突变。此外,RAP的表达水平在rap叶柄中大大降低,将gene31672确定为RAP主要的候选基因。

图2 突变位点及表达量检测

3. RAP 功能研究

RAP 编码谷胱甘肽S-转移酶(GST),F. vesca中有的7个GST同源基因,它们被命名为RAP-L1到RAP-L7,qRT-PCR表达量分析表明,RAP主要在果实中表达较高。为了探索它们对果实着色的贡献,分别在果实成熟的过程的4个发育阶段检测RAP与其它同源基因的表达趋势,RAP-L4在绿色阶段是表达最丰富,RAP从着色阶段开始表达,且表达量较高(图3)。

图3 表达量检测

以上结果表明RAP相比与其它同源基因,在草莓着色发育阶段发挥更重要的作用,构建35S::RAP-RFP 载体转化rap 同源突变体tt19-7,可以互补tt19-7表型,RAP-RNAi 转化材料和对照相比,花青素含量降低,研究发现RAP位于果实特异转录因子FvMYB10的下游发挥作用,调控果实颜色。

总结

本文应用F2群体中27+18的混池BSA分析,通过对候选区段SNP注释分析,成功克隆到RAP基因,它编码谷胱甘肽S-转移酶,参与草莓叶柄及果实花青素的积累,调控叶色及果色形成,后期可用于草莓果色辅助性育种。

 

点击下方按钮,可以与我们的工程师交流,并免费获得设计方案。