分类: 文献解读

中文名:斑马鱼的生物钟通过核激素受体Nr1d1直接调控细胞自噬,通过Cebpb间接调控细胞自噬
英文名:The circadian clock regulates autophagy directly through the nuclear hormone receptor Nr1d1/Rev-erbα and indirectly via Cebpb/(C/ebpβ) in zebrafish
杂志:Autophagy,2016
影响因子:9.108

 

研究背景

细胞自噬是一种非常保守的细胞内降解系统,近期的研究表明小鼠中细胞自噬现象表现出了生物钟节律,nr1d1基因缺陷能导致小鼠骨骼肌中自噬活动的紊乱。然而生物钟调节细胞自噬的机理还不清楚。斑马鱼的细胞自噬活动是否表现出生物钟节律还没有报道,本研究旨在以斑马鱼为实验材料研究nr1d1基因在调节细胞自噬的生物钟节律方面的作用。

 

实验设计

实验材料:2种材料:野生型WT和nr1d1突变型斑马鱼
2个时间点:CT2和CT14(分别为受精后122和134小时);
无生物学重复
测序方法:百迈客Illumina HiSeq2000 PE125

 

 

结果展示

1.表型描述及关键基因在幼鱼和肝脏中的表达情况

首先用TEM(透射电镜)对一天内不同时间(ZT0,ZT6,ZT12,ZT18)的肝脏切片进行观察,统计一天内自噬体数量的变化(红色箭头处,图1,A),并进行统计(图1,B),研究表明斑马鱼肝脏内自噬体的数量符合生物钟节律。

TEM观测及自噬体数量统计结果

选取了几个以前研究过的与自噬体形成、移动、延伸、融合、降解有关的基因进行RT-PCR分析,如maplc3b,bnip3,becn1等。材料为受精后72-96小时的斑马鱼幼体和肝脏材料。由图可见这些基因都表现出明显的生物钟节律。图中白色底色表示白天,灰色底色表示黑夜。

图2 关键基因的RT-PCR检测

2.用TALEN技术构建nrid1突变斑马鱼,并进行表型研究和关键基因表达分析

用TEM观察WT和nr1d1突变斑马鱼肝脏中的自噬体数量,研究表明自噬体数量在nr1d1中明显高于WT。

图3 不同样品斑马鱼肝脏自噬体观测及统计

用RT-PCR研究在WT和nr1d1突变斑马鱼中关键基因的表达差异,nr1d1突变体中基因表达模式与WT中明显不同。

图4 差异基因的RT-PCR验证

3.用ChIP和荧光素酶研究Nr1d1直接调控的下游基因

体外荧光素酶实验表明Nr1d1蛋白能直接结合ulk1a基因的promoter区域,体内ChIP实验进一步证明Nr1d1蛋白能够结合ulk1a基因的promoter区域。说明Nr1d1能直接调控ulk1a基因的表达。

图5 荧光素和chip结果

4. 野生型WT和nr1d1突变型斑马鱼转录组分析

为了进一步说明nr1d1基因的功能,文章选取了野生型WT和nr1d1突变型斑马鱼进行转录组研究,并且取了2个时间点(CT2和CT14)。研究表明在CT2阶段两者有975个差异表达基因,在CT14阶段有1360个差异表达基因。与WT相比,在nr1d1突变体中上调的基因数量要大于下调的基因数量。

同时,选取部分关键的差异表达基因进行RT-PCR验证,结果与转录组分析结果一致。

图6 差异基因韦恩图

图7 差异基因聚类图


图8 关键基因的RT-PCR验证

研究结论

通过研究WT野生型和nr1d1突变型斑马鱼的基因表达情况,表明Nr1d1基因在生物钟调节和细胞自噬过程中起着重要作用。生物钟相关基因直接受Nr1d1调控。此外,通过转录组分析表明Nr1d1还调控胁迫、代谢、信号传导、翻译后修饰等生理过程。

图9 Nr1d1在生物钟和细胞自噬过程中的作用模式图

亮点

1.首次利用斑马鱼研究生物钟和细胞自噬的关系;
2.发现Nr1d1在生物钟调节和细胞自噬过程中的关键作用;
3.转录组研究进一步证明Nr1d1的作用,并揭示Nr1d1其它生理功能。
4.虽然转录组的内容在这篇文章中比重不大,但却揭示了除了生物钟调节和细胞自噬,Nr1d1基因还有很多其它的功能,显著提升了文章的水平,并为后续研究打好了基础。

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