【项目文章】转录组测序研究小球藻的虾青素和三酰甘油的合成通路中的基因表达

中文名：转录组测序研究小球藻的虾青素和三酰甘油的合成通路中的基因表达
英文名：Transcriptome analysis of Chlorella zofingiensis to identify genes and their expressions involved in astaxanthin and triacylglycerol biosynthesis
杂志：Algal Research
影响因子：5.014

 

研究背景

小球藻为单细胞可食用绿藻，能够合成虾青素和油脂；虾青素是一种结构独特的酮式类胡萝卜素，是自然界已知最强的抗氧化剂。含油脂高的藻类可作为生物质能源。

实验设计

材料选择：小球藻 取种子细胞培养到生长对数期的后期，分成3组，用于做不同处理；
处理方式：对照组T1：不做处理；
高光处理组T2：光照90μmol光子−2 s−1，6h；
葡萄糖诱导组T3：30g/L葡萄糖处理， 6h；
测序方法：Hiseq2500，4G/样；

技术路线：

 

研究结果

1. 虾青素和脂类定量分析

对照和葡萄糖处理组相比，葡萄糖诱导下的小球藻中，虾青素含量96h后增加了30倍，而处理组中96h后只增加了8倍。脂类和TFA含量也有类似的情况。对照组中这三种成分增加较少可能是培养基中营养成分限制的原因，在氮饥饿的情况下，导致在相同器官中虾青素和脂肪酸产量增加。

2. RNA-SEQ分析

三种不同的处理构建三个文库，测序获得clean data 10.63G，Trinty组装获得32931个unigenes。52.8%的unigenes在NR,Swiss-Prot,KEGG,GO,COG获得注释。

3. 差异表达基因分析

计算RPKM，做差异表达分析。T1与T2差异表达基因数为580，T1与T2差异表达基因数为1489。在光处理和葡萄糖处理两种情况下，差异基因功能注释表明这些基因都是与翻译、核糖体、蛋白过程、胁迫和碳固定相关的。在光处理下，卟啉和叶绿素代谢、光刺激应答是被富集的。在葡萄糖处理情况想，葡萄糖、能量产生和转化、脂肪合成等都是被富集的；而这些基因在光合作用、核糖体、蛋白运输通路中是减少的。在碳源充足的情况下，生长和能量存储基因是上调表达的，而光合作用是下调表达的。

4. RT-PCR验证

作者选了10个与虾青素和三酰甘油合成有关的unigenes进行了RT-PCR验证，其中9个基因的表达趋势与RNA-seq结果一致。只有PDS两种结果不同，可能是RNA-seq结果不准确，因为前人的研究成果中，葡萄糖是上调PDS表达的，与本文中RT-PCR结果一致。

5. 虾青素合成

在转录组测序结果中，发现MEP通路中的8个基因都被鉴定到，但是在MVA通路中只有2个基因被检测到，其中HMG表达不显著，ACAT表达量下降。这些结果表明小球藻中虾青素的合成通路中IPP和DMAPP是MEP通路合成的。其中，发现一个可能编码β-胡萝卜素激酶（BKT2）与数据库中的BKT1比对率仅为56%。功能分析发现BKT2可以转化β-胡萝卜素成为角黄素。下图为虾青素合成通路图。在葡萄糖处理情况下，与虾青素合成相关的6个基因上调差异表达。在小球藻中，葡萄糖诱导虾青素的合成，伴随着BKT1，CHYb,PDS在24h内上调表达。为研究转录组水平基因表达量与产物含量的关系，分析了5个限速基因的表达量，这些基因在葡萄糖处理72h或92h表达量达到最高，相应的，虾青素的积累量也在96h达到稳定水平。

6. 三酰甘油的合成

藻类和植物中脂肪酸的生物合成主要在叶绿体中进行。乙酰-CoA作为合成的起始物质。基于转录组测序，小球藻质体中脂肪酸合成基因被鉴定到。在葡萄糖处理情况下，这些基因大都表达量上调。另外这次测序结果中还发现几个基因对应的不同转录本。由于BC和SAD是脂肪酸合成的限速酶基因，做了进一步分析，发现BC和SAD表达量从6h到72h表达量持续上升，对应的三酰甘油含量从24h到96h持续增加。

三酰甘油（TAG）合成有两条通路：乙酰-CoA依赖的通路和乙酰-CoA不依赖的通路；转录组数据中两条通路中的基因都被鉴定到。

 

文章亮点

1：材料选择+处理条件；
小球藻关注的成分具有重要的经济价值，处理条件是可以促进经济成分积累，研究更加有利用价值；

2：实验数据+前人结果，深入验证；
测序结果中重点关注关键成分（虾青素和TAG）合成通路中的每一个基因，对其进行差异分析，并做不同时期的表达量分析；解释清楚在处理情况下，物质合成与基因表达的关系。针对本文的研究结果与前人研究成果比较分析。