通过lncRNA-mRNA共表达网络分析长非编码RNA调节蝗虫的型变

中文名:通过lncRNA-mRNA共表达网络分析长非编码RNA调节蝗虫的型变

英文名:Long Non-coding RNA Derived from lncRNA– mRNA Co-expression Networks Modulates the Locust Phase Change

期刊：Genomics Proteomics Bioinformatics

IF：7.051（1区）

通讯作者单位：中科院、河北大学

研究背景

长链非编码RNA（lncRNA）调节基因表达、动物行为等各种生物学过程。尽管蛋白质编码基因、microRNA和神经肽在亚洲飞蝗的表型可塑性调节中起着重要作用，但有关lncRNA在此过程中功能研究较少。本文应用高通量RNA-seq来比较蝗虫型变时程中lncRNA和mRNA的表达模式。结果显示lncRNA在型变的早期阶段反应更快。功能注释表明，早期改变的lncRNA在分散和群居阶段采用了不同的途径来应对种群密度的变化。筛选了分散和群居阶段的网络中两个重叠的中枢lncRNA基因座进行功能验证。本文进一步证明LNC1010057为潜在的蝗虫型变因子。这项工作为深入了解蝗虫型变的分子机制并扩大lncRNA在动物行为中的作用范围提供了重要的数据。

材料方法

实验材料：散居化处理为将群居型蝗虫单独饲养0h、4h、8h和16h后取出手机蝗虫大脑进行测序；

群居化处理为将10只散居型蝗虫与20只群居型蝗虫饲养于一个小笼子（10厘米×10厘米×10厘米）中，于0h、4h、8h和16h后取出，收集蝗虫大脑进行测序。在同一时间点采集样品的三个生物学重复，提取RNA，建立cDNA文库并进行RNA-seq。对lncRNA和mRNA进行差异表达分析及qRT-PCR验证，对不同时间点的样本进行STEM(ShortTime-seriesExpressionMiner)分析，并构建lncRNA–mRNA共表达网络的构建。对目标中心节点lncRNA进行RNAi，采集其行为录像数据进行行为数据分析。

实验结果

1、蝗虫lncRNA的外显子比mRNA少但更长

研究发现大约78％的lncRNA包含2个外显子，而mRNA中包含的外显子数量为1至120（图1C）。因此，lncRNA的外显子明显长于mRNA的外显子（平均长度1142bpvs.263bp，图1D，左）。同时，lncRNA的内含子明显短于mRNA的内含子（平均长度：10086bpvs.12442bp，图1D，右）。表达水平分析表明，lncRNA的总体表达水平明显低于mRNA的表达水平（平均值为0.6vs.1.9；图1E）。但是，表达特异性分析表明，lncRNA的表达受时间限制的程度要高于mRNA（平均值为0.672对0.436图1F）。基于相对于mRNA的lncRNA基因组位置，蝗虫lncRNA被分类为基因间、重叠区、有义内含子、反义内含子、有义外显子和反义外显子。蝗虫77％以上的lncRNA是长基因间的ncRNA（lincRNA，图1G）。这些结果表明，蝗虫lncRNA与mRNA在结构和表达上有很大不同。蝗虫lncRNAs更长，具有更少但更长的外显子和更短的内含子。此外，lncRNA的表达模式显示出比mRNA更高的时间特异性。

2、群居型蝗虫中特异性表达的lncRNA比在散居型蝗虫中表达的更多

在散居型和群居型蝗虫大脑中共表达9722个lncRNA（73.9％），而散居型蝗虫中特异性表达962个lncRNA（7.3％），群居型蝗虫中特定表达2469个lncRNA（18.8％）（图2A，顶部）。分别在散居型和群居型蝗虫中特异性表达了479和1090个mRNA（3.1％和7.1％）（图2A，底部）。这些结果表明，与mRNA相比，在两个蝗虫相型特异性表达的lncRNA的百分比更高，而在群居蝗虫中比散居型蝗虫中表达的lncRNAs更多。与散居型蝗虫相比，群居型蝗虫中335个lncRNA和779个mRNA的表达水平下调，而313个lncRNA和261个mRNA的表达上调[倍数变化（FC）>2和P<0.05；图2B]。lincRNA在下调和上调的lncRNA中所占的比例高（分别为81.2％和87.8％），其次分别是反义外显子和有义内含子lncRNA（图2B）。在表达中按FC排名的前10个lncRNA基因显示在图2C中。这表明散居型和群居型蝗虫大脑中表达的lncRNA的数量及其表达水平明显不同。

3、lncRNA对种群密度变化的快速应答

为了进一步分析lncRNA和mRNA的表达模式，使用了短时间序列表达挖掘器（ShortTime-seriesExpressionMiner，STEM）对基于表达的转录本进行聚类。在CS期间，将214个lncRNA和242个mRNA分别分为8个和9个重要的表达谱（图3D）。其中lncRNA表达谱15以及mRNA表达谱15、13和16直到群居化处理后8或16小时才改变。这些配置文件称为后期更改的配置文件（模式d）。与后期更改的配置文件相反，早期更改的配置文件以4小时时间点开始的转录表达变化为特征。根据4小时后的表达变化，将早期变化的轮廓细分为模式a（早期变化）、模式b（早期中变化）和模式c（可持续变化）。在IG过程中，269个lncRNA和639个mRNA分别聚集成6个和7个显着表达谱。所有lncRNA配置文件均为早期变化（图3E）。在mRNA表达谱中，有6个是早期改变的，而谱12是晚期改变的。在CS和IG期间，lncRNA的聚类分布图的数量与mRNA的分布无明显差异。但是，通过计算谱图中的转录本数量，发现早期改变的lncRNA的百分比比CS中的mRNA的百分比高61.1％（88.3％vs.54.8％，图3F）。同样，IG中早期改变的lncRNA的百分比高于IG中的mRNA（100％vs.81.3％，图3F）。因此，lncRNA比mRNA对散居化和群居化处理的反应更快。在CS中，早期改变的lncRNA的表达变化速率快于285个mRNA的表达变化速率（0.55vs.0.24）和IG（0.77vs.0.39）（图3G）。因此，早期改变的lncRNA的比例和表达变化率高于早期改变的mRNA。因此，蝗虫lncRNA比mRNA对种群密度的变化更敏感。

4、lncRNA参与CS和IG早期变化的不同途径

在CS中，自噬调节、剪接体和肌醇磷酸代谢途径在上位和至少两个模块中均过代表（图4C）。因此，CS中早期改变的lncRNA可能在调节自噬、RNA剪接和信号转导途径中发挥重要作用。lncRNA对自噬的调控参与了群居化的初期和中期，而对剪接体和磷酸肌醇代谢的调控则参与了整个过程。与神经递质释放有关的突触小泡循环途径的lncRNA仅在模式a（早期改变）模块中被过代表（图4C）。该结果表明，早期改变的lncRNA可能在CS期间调节神经系统中具有重要作用。此外，一些lncRNA与已知的型变相关基因密切相关。例如，早期改变的lncRNALNC531328.2、LNC1425451.2、LNC1088763.7和LNC492755.1与基因NPYR、NPF1a和Vat1相关（图4A）。持续变化的lncRNALNC494161.1和LNC1065048.14与多巴胺途径中的基因Ebony和Vat1相关。在CS网络中，程度值前5％的lncRNA被视为hublncRNA（图4A）。计算了lncRNA基因座的程度值，在CS中，基于度数排名前5％的10个lncRNA基因座被鉴定为hublncRNA。其中，四个基因表达上调，其他六个基因表达下调（图4D）。在IG期间，包括谷氨酸能突触、多巴胺能突触和胆碱能突触途径在内的与突触有关的途径得以丰富。这些途径中的大多数都富含早期改变的模块。同时，多巴胺能突触和胆碱能突触途径仅参与模式a（早期改变）的模块（图4E）。IG中也丰富了信号转导途径，例如钙信号传导、Ras信号传导、胰岛素信号传导和MAPK信号传导途径。功能注释的结果表明，与CS相比，IG中早期变化的lncRNA参与的突触相关和信号处理途径更多。

5、LNC1010057可能调节蝗虫型变

为为了验证LNC1010057和LNC992414在蝗虫型变中的功能，进行了一系列分子生物学实验。首先，克隆了在LNC1010057和LNC992414基因座中鉴定出的长的转录本。LNC1010057由重复的A、B和C元素组成，这些元素依次分布并重复4次，但C元素重复三次（图5A）。序列比对证明LNC992414在5’端与LNC1010057共享相似的重复序列，但是它们是从不同的基因组基因座转录而来的（图5A）。尽管LNC992414的定量表达水平可以通过特异性引物检测，但LNC1010057的表达水平为重复元件的总表达水平。如预期的那样，LNC1010057和LNC992414的表达模式极为相似。在CS期间，两种lncRNA的表达持续增加，并且在16h几乎增加了四倍（图5B）。在IG期间，4h后表达水平显着下降，之后保持相对稳定（图5B）。LNC1010057和LNC992414之间的序列结构和表达模式的相似性表明它们是同源的lncRNA。但是，实时qPCR分析表明，在散居型和群居型蝗虫的大脑中，LNC1010057的表达水平比LNC992414的表达水平高约1000倍（图5C）。其次，为了测试LNC1010057和LNC992414是否参与蝗虫型变调节，在通过RNAi抑制蝗虫大脑中的表达后进行了行为分析。显着降低LNC1010057的表达水平（7470对3764610）和LNC992414（1.9vs.1.0）（图5D）后行为分析表明，群居型蝗虫其行为显着改变为散居状态（图5E）。此外，多个与型有关的行为参数发生了变化。总移动距离（TDM）和总移动持续时间（TDMV）显着降低（图5F），但是，移动速度没有区别。同时群居蝗虫的特定喜好行为显着下降（58.3对-13.5图5F）。但LNC992414表达降低并未引起从群居状态到散居状态的转变（图5G和H）。与对照相比，与型相关的行为参数（包括运动和特定物种的优选行为）没有差异（图5I）。LNC992414的RNAi实验不会引起行为变化，因此排除了LNC992414调节蝗虫型变的可能性。这些结果表明是LNC1010057而不是LNC992414潜在地调节了蝗虫的型变。

总结

lncRNA被证实是生物过程的关键调控因子，调节包括mRNA转录、稳定性、翻译和翻译后修饰等多种生物途径。之前研究表明昆虫lncRNA参与了例如杀虫剂抗性、繁殖力和腺体凋亡等生物过程，但是尚未有证据证明lncRNA可以调节非模型昆虫的行为。蝗虫是世界范围内的一种农业害虫，表现出显着的表型可塑性。为了鉴定与其型变相关的lncRNA，本文系统地分析了蝗虫lncRNA的表达并注释其功能，证实与mRNAs相比lncRNAs显示对型变更敏感的响应，并证实了其中一个lncRNA可调节型变相关行为。本研究揭示了lncRNA在蝗虫型变中的重要作用以及表型中蛋白编码基因和lncRNA之间的相互作用。深入解析蝗虫散居型和群居型转变的分子机制，为可持续治理蝗虫的新策略和新方法的开发提供了基础。