【空间转录组】组织到切片的传奇穿越之旅（3）-附上标准视频教程 |

发布于 2021年12月9日

百迈客是国内首批推出推出空间转录组测序服务（百迈客邀您体验新技术——空间转录组），以及国内研发植物空间转录组测序技术（百迈客新品-植物空间转录组挑战与机遇），突破了物种的限制性，还在FFPE样本上实现了客户古董珍贵样本的空间转录组测序（百迈客 10x Visium FFPE 空间转录组预售正式启动！），不仅拓展了空间转录组技术样本适用范围，也扩展了该技术在新领域的应用。

当然新技术的发展依赖于样本的精细处理，特别是植物样本处理和要求跟动物样本要求有一些不同，百迈客经过十几种物种、上百种组织类型的测试，积累了大量的样本处理经验，建立一套稳定组织样本包埋方法，今天为各位老师献上植物空间转录组实验开展中样本准备相关资料，让您的实验不再局限于取材阶段，推动不同物种、不同组织类型在空间基因表达模式的检测，提供单细胞空间多维度探索动植物生长发育、抗逆应激、免疫反应、生物进化等应用技术手段。

首先我们回顾一下在百迈客新品-植物空间转录组挑战与机遇中提到的植物空间转录组实验流程：新鲜组织取材-组织冷冻包埋-冷冻切片-甲苯胺蓝染色-组织优化-建库测序-数据分析，因为植物组织结构上跟动物组织存在很大差异性，在前期样本准备取材工作就显得尤为重要，接下来我们就植物组织样本准备和冷冻包埋过程做一个总结：

样品处理和包埋注意事项

(1) 客户在制备样本时，需要准备8-10个包埋块/样（质检、切片厚度调整、捕获区域确定）：一份用于常规RNA提取，以确保样本自身及样本制备不存在问题，当RNA RIN>7.0时，可进行后续实验；另外部分用于正常的切片厚度调整(10-50μm)和捕获区域确定以及正式实验；

(2) 目前Visium芯片捕获区域大小为6.6×6.5mm2, 因此对组织包埋块的大小有一定要求（≤6.5mm3） ,较小的组织可建议多个组织包埋在一起，组织间隔尽量小，但是不要重叠，多个组织保持在一个水平面，厚度满足1mm以上即可

话不多说，直接献上百迈客植物空间转录组液氮异戊烷冷冻OCT包埋标准样本制备详细步骤攻略，我们先睹为快！
插入视频：

相信看完了视频，大家对组织变成白色的OCT包埋块有了清晰的认识，那这个过程发生了哪些反应呢？小编这里给大家一一讲解此次梦幻传奇之旅：

传奇穿越之旅-装备攻略

首先需要准备此次穿越之旅必备装备，才能穿过重重阻挠，实现组织到包埋块到切片的华丽蜕变。武器装备材料如下：

1. OCT包埋剂（一级装备）：美国樱花OCT冷冻切片包埋剂SAKURA ，货号：4583，规格：118 mL/瓶，获取途径，各种武器店供应商有现货，百元大洋左右，必不可缺，一瓶就可以完成上百次穿越旅行；

2. 包埋盒（一级装备）：冷冻切片OCT包埋盒，7x7x5mm，物廉价美，某宝上只要20元左右就可获取百件同等级别装备；

3. 异戊烷（一级装备）：CAS号78-78-4，规格500 mL，可直接购买，但装备易燃，请小心使用；

4. 液氮、1xPBS、镊子、剪刀、冰块、培养皿（二级装备）、吸水纸：可购买或自行配置。

图1：装备攻略示意图

在无菌超净台中，用异戊烷（足以完全浸没组织包埋盒）填充三分之二的金属烧杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮与异戊烷保持相同的水平面）以充分接触，孵育 5-10 分钟，时间不宜太久，防止异戊烷凝结。

将包埋盒（冷冻切片OCT包埋盒，7x7x5mm）放置在冰上，标记包埋盒（组织放置的方向、样品名称等）（可拍照记录），在包埋盒底部加入适量的OCT包埋剂（美国樱花OCT冷冻切片包埋剂SAKURA ，货号：4583，规格：118 mL/瓶），约1/4深度，微凝固后待用，防止组织沉底直接接触包埋盒底部；

图2 包埋剂、冲洗液、包埋盒、异戊烷预处理示意图

FAQ 1: 植物组织必须要进行液氮异戊烷冻存吗，能否用其它方法替代？

答：目前植物细胞具有细胞壁和液泡，细胞中存在大量水分更容易在低温冷冻过程中形成冰晶，损伤植物组织细胞的结构形态，而且冷冻后植物样品比动物样品硬度大，难以切片和保持植物组织结构的完整性。常用方法直接包埋法、液氮速冻法【1】以及繁琐的FAA、多聚甲醛或乙醇等固定液固定都无法快速得到较好的植物组织冷冻切片效果，这里推荐了液氮异戊烷冷冻-OCT包埋法（百迈客已经完成近1000个样本测试），液氮可以快速冷冻，组织在异戊烷中未直接接触液氮既可以防止RNA降解，还避免形成晶体，防止组织形态受损。如果组织类型硬度较大或者木质化程度较高或者组织器官存在很多空隙样本，可以推荐蔗糖溶液作为冷冻保护液，将植物组织放在合适浓度蔗糖溶液中固定，用对应浓度的蔗糖磷酸缓冲液浸洗，最后抽真空的方法可较大达到包埋切片效果。

FAQ 2: 植物组织包埋剂选择，是否必须使用OCT包埋剂？

答：目前空间转录组推荐使用标准包埋剂就是OCT（樱花牌，SAKURA ，4583），必须使用，已经在Stefania[2][3]方法中得到验证，在植物器官组织表面涂抹一层OCT组织包埋剂（水溶性乙二醇和树脂组成）可以较好保存组织切片的完整形态，其优点在前期提到过：
1）保留组织结构并在冷冻切片过程中提供结构支撑；
2）在切片过程中保持最*温度，从而使切片光滑；
3）由于其水溶性，可与多种染色程序兼容。通过樱花牌OCT包埋剂可以达到植物空间转录组测序样本制备的要求。

FAQ 3：所有的试剂、包埋盒是否都需要在冰上操作？

答：是需要，为了降低植物组织RNA降解的可能，需要对相应的器具、试剂放在4℃环境中预冷，也就是前期一些工作需要在冰上操作完成，尽可能减少组织RNA的降解。

传奇穿越之旅-取材攻略

从活体植株上取下新鲜目标区域组织置于培养皿中，利用4℃预冷的镊子和剪刀尽量将组织裁剪成 6.5mm3大小（大小要适宜，现阶段芯片大小为6.5×6.5mm2，一般组织覆盖率达到芯片25%以上，低于25%建议多个包埋），利用预冷的蒸馏水将组织冲洗三次，用吸水纸轻轻吸干组织表面的溶液。

图3 植物空间转录组组织样本取材预处理示意图

FAQ 4：可否使用其他植物组织缓冲液？

答：本方法推荐蒸馏水作为植物组织表面清洗缓冲液，不建议直接用1xPBS作为植物组织表面清洗缓冲液，为了维持组织形态结构原始稳定性，高浓度PBS会导致植物组织细胞容易收缩变形，选择蒸馏水可以简单快速清洗干净表面污渍。如果采用蔗糖溶液作为冷冻保护液，可以采取相应浓度蔗糖（1x PBS配置）做为植物清洗缓冲液。

FAQ 5：植物组织太小该如何包埋才能最大限度利用芯片覆盖度？

答：为了保证最大限度利用芯片覆盖度，解决组织样本太小情况，这里推荐多个组织包埋在一起，组织间隔尽量小，但是不要重叠，多个组织保持在一个水平面，如上图所示。另外一定要备注清楚方向和每个样本形态结构，后续数据分析，需要清楚知道对应样本切片位置，此时应该清楚备注每个样本方向和位置信息。

传奇穿越之旅-冷冻包埋

在冰上操作，用镊子轻轻夹住组织，缓慢加入预冷的OCT包埋剂，直至OCT完全包裹组织，并调整组织在OCT中的位置，保证目标平面与切面水平一致，尤其是多个组织包埋一定要排列整齐，避免重叠在一起，此过程中避免产生气泡，如有气泡产生用用针尖轻缓挑出气泡。

图4 植物空间转录组组织OCT包埋示意图

图5 植物组织块在包埋盒中示意图

选择最小规格包埋盒（7*7*5mm），组织块合适大小（6.5mm3）

用镊子夹紧包埋盒，使异戊烷没过其底部但不淹没整个包埋盒，不要使异戊烷浸入包埋盒内（组织不直接接触异戊烷），当OCT由透明转变为完全不透明的白色块状时，组织基本完全冻结，取出包埋盒并放入-80℃冰箱保存（在室温下，异戊烷温度会迅速升高，冷冻过程中一旦异戊烷升温，需要马上置于液氮中重新冷却）或直接进行切片。冷冻时间可根据组织类型和大小而变化。

图6 植物组织块液氮异戊烷冷冻示意图

图7 植物组织块根、茎、胚芽鞘、花苞、芽等组织液氮异戊烷冷冻OCT包埋块示意图

传奇穿越之旅-密封运输

将 OCT 包埋的组织块或者包埋盒直接保存在–80℃的密封容器中（一般利用锡箔纸包裹整个包埋盒或者扣下包埋块将包埋块放入50 mL离心管密封处理），并做好样本信息标记，利用干冰运输。

图8 植物组织OCT包埋块密封处理示意图

FAQ：这种液氮异戊烷冷冻-OCT包埋的植物组织可以-80℃存放多久？

答：2个月。理论上密封处理后可以-80℃长期保存，与动物组织不同，植物组织脆弱性和结构特异性，液氮异戊烷冷冻-OCT包埋的植物组织在-80℃可以储存2个月左右，就要进行切片实验和后续实验，不然也会影响切片效果和RNA降解。

本期【空间转录组】植物组织到冷冻切片的传奇穿越之旅基本上到此就告一段落，后需会继续为大家奉上第二部传奇之旅，详细说明植物组织冷冻切片如何实现空间位置基因表达信息的穿越，这其中又有经过多少难关才能实现我们的最终穿越。欲知更多百迈客植物空间转录组后续实验和实测数据分析，尽在下期分享，敬请期待。

百迈客空间转录项目经验

图9. 百迈客空间转录组动物冷冻组织切片HE染色

图10. 百迈客空间转录组植物冷冻组织切片甲苯胺蓝染色

百迈客空间转录组优势

◆多物种：人、鼠、哺乳动物、植物等多物种均可开展空间转录组检测服务

◆多样本类型：冷冻组织、FFPE组织多种组织类型都可以实现空间转录组测序

◆ 设备全：拥有冷冻切片机、石蜡切片机、多系统荧光显微镜，可满足多样本空间转录组高通量测序，一次性多通道、多样本，实现高效空间转录组测序服务；

◆ 经验丰富：国内首批引进10x visium 空间转录组测序平台，目前累计成功制备50余种组织类型、1000+例的空间转录组样本

◆强大生信分析：可提供基本分析和高阶分析，满足个性化调整

◆全套服务：组织样本切片、固定、透化、建库、测序、数据分析全套服务

◆单细胞和空间云分析平台：百迈客云平台已经研发快速高效的云平台，可高效呈现高质量文章图表和对大数据进行挖掘；

◆空间转录组&单细胞联合分析：空间转录组多组学联合分析，可近似实现单细胞分辨率空间转录组基因表达特征，交互式分析。

百迈客年末促销，钜惠来袭

活动1：单细胞X平台惊爆价：17000元起/样，5台华为笔记本免费送（价值5600元）；

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参考文献：

[1]陆振芳, 蒋素华, 江敏,等. 蝴蝶兰花器官冰冻切片技术探讨[J]. 河南农业大学学报, 2019, 053(002):200-206.

[2] Giacomello S, Salmén F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017 May 8;3:17061.

[3] Giacomello S, Lundeberg J. Preparation of plant tissue to enable Spatial Transcriptomics profiling using barcoded microarrays. Nat Protoc. 2018 Nov;13(11):2425-2446.