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1、提取方法

1)植物叶片：（天根 DP441（厂家：天根，型号：DP441）

2)植物根、茎、种子：艾德莱 RN40（厂家：艾德莱，型号：RN40））试剂盒

3)动物常规组织：TRIzol

4)皮肤、毛发：凯捷 217044（厂家：凯捷。型号：217004）

5)全血PAX管送样：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（厂家：GENENODE。型号：2145A）试剂盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Nanodrop2000 （厂家：赛默飞，型号 ：Nanodrop2000）对于提取的核酸进行浓度纯度检测，并使用 LabChip GX（厂家：铂金埃尔默，型号：LabChip GX Touch HT）对完整性进行检测

2.2判定标准

1)总量≥1（ug），满足 2 次建库

2)浓度≥20（ng/ul）

3)体积≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之间，OD260/230 在 0.5-2.5 之间，260nm 吸收峰显示正常

5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同时若GX检测6.0-6.4的需结合基线判断，28S/18S≥1 且基线无上抬或轻微上抬

6)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

3、建库方法

3.1建库流程

1) 全长cDNA的合成

A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下试剂

Reagent Volume（μL）
Total RNA（1ug） X
3’ SMART®CDS Primer II A (12 μM) 1
Nuclease-Free Water 3.5-X
Total Volume 4.5

B.轻弹混匀，瞬时离心，置于PCR仪上

C.72℃ 3min，42℃ 2min，72℃到42℃降温速率设置为 0.1℃/s

D.在上步反应期间，配制如下Mix

Reagent Volume（μL）
5X First-Strand Buffer 2
DTT (100 mM) 0.25
dNTP Mix (10 mM ) 1
SMARTer II A Oligonucleotide (12 μM) 1
RNase Inhibitor 0.25
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U) 1
Total volume added per reaction 5.5

E.轻弹混匀，瞬时离心，42℃预热1min后立即进行下步反应

F.取5.5μL预热的Master Mix加入上步反应完成的PCR管中；轻弹混匀，瞬时离心

G.42℃ 90min，70℃ 10min

H.向上述反应完成的cDNA产物中加入70 μL Elution Buffer（试剂盒自带，后边简称EB）进行稀释（总体积80μL）

2)PCR扩增

A.取一新的1.5mL 离心管，加入如下试剂

Reagent Volume（μL）
Diluted first-strand cDNA 80
5’ PCR Primer II A (12 μM) 8
5X PrimeSTAR GXL buffe (5X) 80
dNTP Mix (2.5 mM each) 32
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(1.25 U/μL） 8
Nuclease-free water 192
Total Volume 400
Reagent Volume（μL）

B.轻弹混匀，瞬时离心，将Mix平均分到0.2mL PCR管中（每管50μL）

C.将PCR管置于PCR仪上，按照PCR条件进行PCR扩增

98℃ 30s  
98℃ 10s 12cycles
65℃ 15s
68℃ 10min
98℃ 5min

3)PCR纯化

A.将上步PCR产物分别导入一新的1.5mL低吸离心管中

B.向50μL体积1.5mL离心管中加入0.5X（25μL）体积的AMPure®XP磁珠，充分混匀，瞬时离心

C.置于四维旋转仪上混匀结合15 min

D.瞬时离心，将样品置于磁力架上至上清液澄清（约2min）

E.弃上清，保持离心管于磁力架上，沿对壁加入1.5mL的新配置的80%乙醇，静置30s

F.弃上清，重复漂洗一次

G.弃尽上清，室温干燥30 s

H.向两个1.5mL离心管分别加入22μL的Elution Buffer，轻弹混匀，置于四维旋转仪上5min

I.置于磁力架上2min，转移上清液至新1.5mL离心管

J.取2μL稀释液进行Qubit定量，确定PCR产物总量

4)DNA修复

A. 向纯化产物中分别加入以下试剂

试剂 体积（μL）
Repair buffer 8
End repair Mix 4
DNA repair mix 2
总体积（Reaction Mix 1） 14

B.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1s

C.向每个样品中加入14μL Reaction Mix 1

D.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀，瞬离1s

E.孵育

温度 时间（min）
37℃ 30
65℃ 5
4℃ Hold

5)接头连接

A.向上述产物中加入以下试剂

试剂 体积（μL）
SMRTbell adapter 4
Ligation mix 30
Ligation enhancer 1
总体积（Reaction Mix 2） 35

B.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀上述样品，瞬离1s

C.向每个样品中加入35μL Reaction Mix 2

D.使用宽口枪头轻轻吹打10次，混匀，瞬离1s

E.孵育

温度 时间（min）
20℃ 30
4℃ Hold

6)PB纯化

A.向样品中中加入1*体积的SMRT bell cleanup beads（室温平衡30min）

B.使用宽口枪头轻轻吹打15次，混匀上述样品，瞬离1s

C.室温放置10min，瞬离1s

D.转移离心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，将上清液转移到新离，备用

E.使用1.5ml新配的80%酒精洗涤磁珠，30秒后弃掉酒精，重复一次

F.瞬离1s，将酒精弃净

G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用宽口枪头轻轻吹打15次，进行混匀

H.室温5min溶解DNA，瞬离1s

I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附离心管中

J.取1μL稀释5倍，使用Qubit进行浓度测定

4、测序方法

1)使用Sequel II Binding kit 2.1（Pacbio，USA） 对上机文库进行上机前的结合，使文库结合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）

2)将最终的反应产物进行AMPure PB（Pacbio，USA）纯化后置于SequelII（Pacbio，USA）测序仪上进行测序

5、实验试剂

物料名称 厂家 货号
SMARTer® PCR cDNA Synthesis Kit TAKARA 634925
Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer 英潍捷基 Q32854
Agencourt® AMPure® XP Beckman A63882
SMRTbell Prep Kit 3.0 PACBIO 102-182-700
SMRTbell cleanup Beads PACBIO 102-158-300
AMPure PB PACBIO 102-182-500
Sequel II Binding kit 2.1 PACBIO 101-626-600
Sequel II Sequencing 2.0 Bundle (5 pack of 4 rxn plates) PACBIO 101-849-000
SMRT Cell 8M PACBIO 101-389-001

6、实验设备

仪器名称 生产厂家 型号
瞬时离心机 天根生化科技（北京）有限公司 OSE-MC8
﹣20℃度冰箱 青岛海尔特种电冰柜有限公司 BC/BD-629HK
4°C 冰箱 海尔 HYC-360
涡旋振荡器 SCIENTIFICINDUSTRIES.INC vortex-2G560E
基因扩增仪 Appliedbiosystems veriti96well9902
恒温金属浴 Eppendorf ThermoMixer F1.5
磁力架 赛默飞世尔 DynaMag96Side skirted
测序仪 Pacbio SequelII

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