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1、提取方法

1.1植物组织：CTAB法

1)液氮研磨样品，分装至离心管中

2)向离心管中加入 CTAB，水浴

3)离心后向上清中加入氯仿/异戊醇（24:1），离心

4)向上清中加入异丙醇和乙酸钠溶液，离心，弃上清

5)加入 75％乙醇，离心，弃上清

6)晾干，加入 TE 溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2动物组织：SDS法

1)液氮研磨组织样，分装至离心管中

2)加入 SDS 溶液，水浴

3)加入 NaCl 溶液，静置后离心

4)向上清中加入氯仿/异戊醇（24:1）后离心

5)向上清中加入异丙醇后离心，弃上清

6)加入 75％乙醇，离心，弃上清

7)晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3动物血液：Kurabo 试剂盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，厂家：Kurabo，货号：40321300101

1.4粗体核酸纯化

试剂盒名称：QIAGEN Genomic-tip 20/G，厂家：QIAGEN，货号：10223

试剂盒名称：QIAGEN Genomic-tip 100/G，厂家：QIAGEN，货号：10243

1.5微生物样本

使用TGuide S96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒完成核酸的提取

2、检测方法

2.1检测方法

1)浓度检测

Nanodrop：赛默飞 Thermo ，型号 NANODROP2000

Qubit：invitrogen ，型号QubitTM3Flurometer

2)完整性检测（琼脂糖凝胶电泳）

电泳仪：厂家：天能 Tanon ，型号 EPS600

电泳槽：厂家：天根生化科技（北京）有限公司，型号：HE- 120

2.2判定标准

1)总量≥6μg（单次建库）

2)浓度≥50ng/ul

3)体积≥10(ul)

4)OD260/280在1.7-2.2之间，OD260/230在1.7-2.5之间

5)AGE：size≥23K，降解条带>5K，点样孔无或有轻微污染，N/Q在0.9-2.0之间

6)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

注：特殊物种实验人员会根据经验进行判断，具体以检测报告中的判断结果为准

3、建库方法

3.1建库流程

1) 准备高质量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化

2)使用BluePippin进行片段筛选

3)使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的损伤修复和末端修复加 A

4)使用无扩增条形码扩展试剂盒添加 barcode 序列

5)使用无扩增条形码扩展试剂盒完成测序接头的连接

3.2建库试剂

1)文库构建试剂：NEBNext FFPE DNA Repair Mix 货号 M6630L 厂家 NEB

2)文库构建试剂：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 货号E7546L 厂家NEB

3)文库构建试剂：无扩增条形码扩展试剂盒1-96 货号SQK-NBD114.96 厂家Nanopore

3.3建库设备

数字 3*32PCR 仪 厂家 Appliedbiosystems 仪器规格 proflex3*32

制冷型程控五段金属浴 厂家 天根生化科技（北京）有限公司 仪器规格 OSE-DB-02

4、测序方法

4.1上机操作

1)用测序芯片制备试剂盒配制 Flow cell Priming mix

2)用测序辅助扩展试剂盒配置上机文库

3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48测序仪运行MinKnow 软件，开始测序，默认运行72 小时

4.2测序试剂

测序芯片制备试剂盒 货号 EXP-FLP004 厂家 Nanopore

测序辅助扩展试剂盒 货号 EXP-AUX003 厂家 Naonopore

测序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 货号 FLO-PRO114M 厂家 Nanopore

4.3测序设备

PromethION48 测序仪 厂家 Nanopore 仪器规格 PromethION48

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