Nanopore全长转录组测序数据评估

纳米孔测序是一种由ONT（Oxford Nanopore Technology）研发的单分子测序技术。在转录组测序应用中，相比于传统二代RNA-Seq测序技术，长读长的纳米孔RNA测序可以在无需打断的条件下得到全长序列并进行定量，同时直接RNA测序还可以检测多种碱基修饰，且测序无需扩增，减少了PCR过程引入的碱基偏倚。

ONT测序技术在多个方面具有非常强悍的优势，然而，一份合格的下机数据才是科研成功研究的基础，为保证得到准确的转录组结构分析和定量结果，需要对测序数据进行严格的质控评估。那么我们今天一起学习一下《Summary statistics and QC tutorial》，ONT官方提供的对测序raw data进行全面数据质控的教程。

介绍

此教程适用于指导对单个nanopore测序芯片产出的数据进行评估，评估的主要内容如下所示：

1、测序产出（测序得到多少reads，多大数据量）；

2、测序数据的质量和长度分布；

3、如果加入了barcode序列进行混样建库，测序数据在不同样品的分布。

准备

1、下载教程相关文件

直接到教程的github页面下载或通过git命令下载：

git clone https://github.com/nanoporetech/ont_tutorial_basicqc.git QCTutorial

后续分析会用到下载目录QCTutorial下的以下内容：

1) Nanopore_SumStatQC_Tutorial.Rmd：Rmarkdown文件，说明文档和用于执行分析。

2) RawData/lambda_sequencing_summary.txt.bz2：示例文件，Guppy对测序reads进行碱基识别生成的相关信息文件。

3) RawData/lambda_barcoding_summary.txt.bz2：示例文件，用于区分混样建库时多样品的barcode信息。

4) environment.yaml：指定分析所需软件包及计算环境的文本文档。

5) config.yaml：配置文件，用于指定分析所需的输入。

2、创建Conda环境

为了方便执行分析所需软件包及其依赖的安装及管理，需要安装Conda并创建用于此分析的环境。

1) Conda安装（Python3版本的Miniconda）：

wget https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash

2) 创建Conda环境及环境激活（第1步中下载的environmen.yaml用于环境初始化）：

创建环境：conda env create –name BasicQC –file environment.yaml

激活环境：source activate BasicQC

分析

进行分析之前需先准备配置文件，通过修改准备步骤下载的config.yaml中相应的参数来完成，需要修改的内容主要有：

 

注：如为单样品测序无barcode信息，则barcodeFile部分为空。

准备完成后，可以通过命令行启动分析，命令如下：

R –slave -e ‘rmarkdown::render(“Nanopore_SumStatQC_Tutorial.Rmd”, “html_document”)’

如果习惯图形界面操作，也可以通过Rstudio载入Rmarkdown文件执行分析：

结果

上述分析完成后会将分析结果存放至HTML文件，可用浏览器打开Nanopore_SumStatQC_Tutorial.html进行查看。对单个芯片约1M reads分析的部分结果展示如下（结果来自教程，碱基识别使用Guppy 2.1.3，根据识别序列的平均质量值将其分为pass和fail两种，质量值阈值默认为7）：

1、总结

展示了数据产出的总体情况（如下图，本分析中碱基识别共产出991,715条序列，14.6G碱基）。

2、质量长度

此部分展示了对识别出的所有序列质量和长度信息的统计结果，包括序列的平均长度，N50和平均质量，序列长度和质量的密度分布等

3、测序表现

此部分内容统计了随测序时间变化，测序累计序列个数，碱基个数，测序速度和有效工作纳米孔数等指标的变化情况。

4、区分混样

在加入barcode序列混样测序的情况下，barcode识别区分的结果展示如下，包括barcode识别效率，区分的文库个数及每个文库中序列个数占比和长度信息等。

上面展示了分析结果的部分内容，更多细节的内容可参考底部的相关链接。

rawdata的质控评估只是整个信息分析的开始，是为了对测序数据有大致的整体认识，以便更好地指导后续分析。然而分析的每个环节都会对最终结果产生影响，因此每一步的处理都要深思熟虑。

小编寄语

2018年8月牛津纳米孔公司与百迈客公司达成长期合作，拥有MinION、GridION X5和PromethION三种型号全套纳米孔测序仪。至今已积累了丰富的项目经验，全长转录组成功案例先后发表在《Plant Biotechnol J》、《J Hazard Mater》、《Biotechnol Biofuels》、《Sci Rep》、《Fish & Shellfish Immunology》等国际知名期刊，已发表文章研究物种分别有杨树、吴松草、风筝果、甘薯、野生甘薯、兔子、跳甲、花羔红点鲑和辣椒，覆盖领域分别为林木、哺乳动物、昆虫、水产和作物等。

如您有任何全长转录组等相关问题，欢迎点击下方按钮，我们将竭尽全力为您答疑、设计方案和提供高分成功案例等。

 

参考链接:

https@//github.com/nanoporetech/ont_tutorial_basicqc(@换成:)

https@//community.nanoporetech.com/knowledge/bioinformatics(@换成:)