Trans-BGI 实验流程材料方法

1、提取方法

1)植物叶片：（天根 DP441（厂家：天根，型号：DP441）

2)植物根、茎、种子：艾德莱 RN40（厂家：艾德莱，型号：RN40））试剂盒

3)动物常规组织：TRIzol

4)皮肤、毛发：凯捷 217044（厂家：凯捷。型号：217004）

5)全血PAX管送样：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（厂家：GENENODE。型号：2145A））试剂盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Nanodrop2000 （厂家：赛默飞，型号： Nanodrop2000）对于提取的核酸进行浓度纯度检测，并使用LabChip GX（厂家：铂金埃尔默，型号LabChip GX Touch HT）对完整性进行检测

2.2判定标准

1)总量≥1（ug），满足 2 次建库

2)浓度≥20（ng/ul）

3)体积≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之间，OD260/230 在 0.5-2.5 之间，260nm 吸收峰显示正常

5)RIN 值≥4.0（非植物），RIN 值≥4.0（植物），同时若 GX 检测 6.0-4.0 的需结合基线判断，28S/18S≥1 且基线无上抬或轻微上抬

6)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

3、建库方法

3.1mRNA纯化及打断

1) mRNA与磁珠第一次结合

A.将 mRNA Capture Beads 置于四维旋转仪上充分混匀，平衡 30min 后使用

B.将 mRNA Capture Beads 加入到准备好的总 RNA 样品中混匀，65℃孵育，使 RNA 变性

C.变性结束后，室温放置 5min ，使 mRNA 结合到磁珠上

D.将样品管置于磁力架上静置，磁珠充分吸附到磁铁一侧后，移弃上清液

E.将样品从磁力架上取出，用Wash Buffer 吹吸后置于磁力架上，磁珠充分吸附到磁铁一侧后，移弃上清液

F.将样品从磁力架上取出，加入 Tris Buffer 吹吸混匀，80℃洗脱mRNA

2) mRNA 与磁珠第二次结合

A.向上步离心管中加入 Beads Binding Buffer ，吹吸混匀，室温放置 5min ，使 mRNA 重新结合到磁珠上

B.将样品置于磁力架上，使磁珠充分吸附到磁铁一侧，然后移弃上清液

C.将样品从磁力架上取出，用 Wash Buffer 吹吸混匀，置于磁力架上 2min ，移弃上清液

D.将样品从磁力架上取出，加入 Frag/Prime Buffer 并吹吸混匀

3) mRNA 的打断

将上述 mRNA 产物中加入放入 PCR 仪中，根据样品质量等情况判定相应的打断条件，打断完成后立即放在冰上。

3.2合成 cDNA 第一条链

向上步反应的离心管中加入反转录第一条链所需的试剂，混匀离心后放入 PCR 仪中设定好程序进行cDNA 第一条链的合成

3.3合成 cDNA 第二条链（含末端修复及加A尾）

向合成的 cDNA 第一条链产物中依次加入二链合成反应的试剂，混匀离心后放入 PCR 仪中设定好程序进行二链的合成

3.4连接接头

向上述反应产物中依次加入接头和连接酶，金属浴中孵育，进行接头连接反应

注：Adaptor 中包含 Index 序列，使用时需严格按照上机调度安排的序列添加

3.5连接产物纯化及片段选择

1)向上述反应产物加入相应体积的（0.6X）已混匀的磁珠，混匀，室温孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到 磁力架一侧后移弃上清液

2)离心管置于磁力架上，加新鲜配制的 80% ethanol ，静置 30s ，移弃上清液

3)重复步骤 2 一次，第二次清洗后离心用 10ul 枪头将上清液去除干净

4)离心管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥

5)取下离心管，加入 Nuclease-free Water，混匀，室温孵育，而后置于磁力架上静置，吸取上清液转入新的离 心管中

6)向上述离心管中加入（0.6X） 已混匀的磁珠，混匀，室温孵育而后置于磁力架上

7)吸取上清液转移至新的离心管中，并向该离心管中加入（0.1X）已混匀的磁珠，混匀后室温孵育

8)孵育结束后置于磁力架上，待磁珠和上清液分开后弃掉上清液

9)离心管置于磁力架上，加入新鲜配制的 80% ethanol，磁力架上静置 30s，移弃上清液；重复该步骤一次

10)离心管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥

11)取下离心管，加入 Nuclease-free Water，吹吸混匀，室温静置；而后磁力架上静置 ，吸取上清液转入新的 0.2ml 离心管中

3.6PCR 扩增

向上述离心管中加入 PCR 反应所需的各种试剂，混匀后离心，根据 PCR 反应条件，放入 PCR 仪中进行 PCR 扩增

3.7PCR 产物纯化

1)瞬时离心 PCR 反应管，加入相应体积的磁珠，充分混匀

2)室温孵育，然后置于磁力架上静置，小心移除上清液

3)向反应管中加入新鲜配制的 80% ethanol ，磁力架上静置 30s ，移弃上清液，重复该步骤 1 次

4)打开管盖，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脱 DNA ，吹吸混匀，室温静置，磁力架上静置，小心 吸取上清至新的离心管中，并分装 1.5 μL 于新的 1.5 mL 离心管中用于片段检测，-20℃保存

3.8文库质检

文库通过 Qsep-400 方法进行质检，满足如下指标即可上机检测

3.9引物接头序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.10建库试剂耗材

1)文库构建试剂盒：Hieff NGS Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina（翌 圣），货号 13533ES96

2)产物纯化磁珠：HieffNGS DNA selection Beads (Superior Ampure XPalternative)（翌圣），货号 12601ES56

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

3.11建库设备

4、测序方法

测序设备：BGI测序仪（型号：DNBSEQ-T7）