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1、提取方法

1)样本研磨

2)将装有样品的离心管加入1 ml 65 ℃预热的CTAB提取液和2%的巯基乙醇（如 果是动物组织的话加50ul浓度为20mg/ml的蛋白酶K），在涡旋振荡仪上震荡混匀，使样品完全悬浮，65 ℃烘箱温浴40 -60min，不能超过1h

3)温浴期间摇匀2-3次，保证裂解充分。取出后，冷却至室温

4)12000 rpm离心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 无菌离心管中（。加入等体积三氯甲烷/异戊醇（24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm离心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 无菌离心管，加入等体积三氯甲烷-异戊醇 （24:1），上下颠倒混匀， 12000 rpm离心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml无菌离心管中，加入上清液体积的2/3体积（300ul）的异丙醇和1/10体积（45ul）的3M乙酸钠，充分混匀，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm离心10min（如果从-20℃取出后絮状沉淀较多，可12000rpm离心20s），弃上清，瞬时离心，用200ul枪头吸弃多余液体

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，轻弹至沉淀悬浮，12000rpm离心5min，弃上清

9)瞬时离心，用黄枪头吸弃多余液体，离心管开盖室温晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明状

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超纯水，根据沉淀大小决定融水体积，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴锅消化1 h后保存在-20 ℃冰箱备用

注：常规植物组织提取正常使用CTAB提取，疑难植物（蔷薇科等多糖类植物）组织裂解前使用干扰（清洗掉部分多糖等杂质）先清洗，清洗完之后在加裂解液；动物组织在裂解时加入2%的蛋白酶K；宏基因组项目提取在裂解时加入5%-10%的溶菌酶

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Qubit（厂家YEASEN, 型号CAT 12642-A ，试剂1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）检测核酸浓度，使用1%的琼脂糖电泳检测完整性

2.2判定标准

浓度≥1ng/ul

总量大于等于 30ng

完整性主带清晰、主带不清晰，主要弥散在2K以上，跳带、或严重锯齿状、或“H”形或下方有非常严重的非RNA样弥散等

核酸状态正常

3、建库方法

3.1基因组打断加样（酶切打断）及末端修复

1)样品稀释分装

A.取基因组DNA 10ng（qubit定量）进行建库

B.向以上 DNA中加入以下试剂立即置于PCR仪中进行反应

试剂 体积（μL）
Input DNA X
FEA Buffer 2
FEA Enzyme Mix 4
Total 20

2)酶切打断（75℃热盖）

a 4°C for 15s
b 37°C for 8 min
c 65°C for 30min
d Hold at 4°C (勿长时间放置, 以免对PCR仪产生不必要的损坏)

3.2接头连接

1)试剂体系

试剂 体积 (μL)
打断末修加A产物 20
Rapid Ligation Buffer 3 10
DNA Adapter 2
Rapid DNA Ligase 2
ddH2O 6
TotalVolume 40

2)操作流程

A.向打断末修加A产物加入以上试剂和 DNA Adapter

B.按照下述程序PCR仪上反应

a 热盖off
b 20°C for 15 min
c Hold at 4°C (勿长时间放置, 以免对PCR仪产生不必要的损坏)

3)连接产物纯化

用Vazyme DNA Clean磁珠对上述步骤中的PCR产物做0.8×磁珠纯化

4)片筛纯化

A.向上述产物中加入（0.485×）磁珠，混匀后室温孵育5 min；而后置于磁力架上，吸取全部上清液至新的96孔板中

B.加入（0.1×）磁珠，混匀后室温孵育5 min；而后置于磁力架上，移弃上清液

C.80%乙醇清洗磁珠两次后移弃上清液

D.加入10 μL nuclease-free water，混匀后室温静置5 min；而后磁力架上，吸取8 μL上清液进行下一步PCR扩增

3.3PCR 扩增

1)PCR体系

试剂 体积(μL)
PCR Primer Mix 3 2
VAHTS HiFi Amplification Mix 10
片筛产物 8
Total volume 20

2)PCR程序

3.4PCR 产物纯化

用Vazyme DNA Clean磁珠对上述步骤中的PCR产物做0.6×磁珠纯化，得到合格文库

3.5文库质检

1)质检方法：文库通过 Qsep-400 进行片段质检， 使用 Qubit 3 .0 进行文库浓度的定量

2)质检标准：浓度≥1ng/ul， 质检片段中心值430-530bp， 平均值420-580bp 之间， 峰型呈正态分布， 片段单一无杂峰

3.6引物接头序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.7建库试剂耗材

1)文库构建试剂盒：VAHTSTM Fg DNA Library Prep Kit  for I11umina 货号ND617-02

2)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 货号N411-03

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

3.8建库设备

设备 厂家
PCR仪 艾本德
金属浴 天根
掌上离心机 天根生化
漩涡震荡器 SCIENTIFICINDUSTRIES.INC
移液枪 RAININ 瑞宁
磁力架 Life
相机 索尼
冰箱 海尔
四维旋转仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司
质检使用仪器 Bioptic-Qsep400
定量使用仪器 赛默飞Qubit 3.0

4、测序方法

测序设备： BGI测序仪（型号：DNBSEQ-T7）

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