LncRNA实验流程方法

 

1、提取方法

1)植物叶片：（天根 DP441（厂家：天根，型号：DP441）

2)植物根、茎、种子：艾德莱 RN40（厂家：艾德莱，型号：RN40））试剂盒

3)动物常规组织：TRIzol

4)皮肤、毛发：凯捷 217044（厂家：凯捷。型号：217004）

5)全血PAX管送样：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（厂家：GENENODE。型号：2145A）试剂盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、检测方法

2.1检测方法

使用 Nanodrop2000 （厂家：赛默飞，型号： Nanodrop2000）对于提取的核酸进行浓度纯度检测，并使用LabChip GX（厂家：铂金埃尔默，型号：LabChip GX Touch HT）对完整性进行检测

2.2判定标准

1)总量≥1（ug），满足 2 次建库

2)浓度≥20（ng/ul）

3)体积≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之间，OD260/230 在 0.5-2.5 之间，260nm 吸收峰显示正常

5)RIN 值≥4.0（非植物），RIN 值≥4.0（植物），同时若 GX 检测 6.0-4.0 的需结合基线判断，28S/18S≥1 且基线无上抬或轻微上抬

6)样本状态正常，样本粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格

3、建库方法

3.1rRNA去除

1) rRNA与探针结合

A.将对应物种的去rRNA探针混合物加入到准备好的总 RNA 样品中，混匀离心，68℃孵育确保RNA变性

B.孵育结束后，将PCR管置于室温，孵育2 min

2)rRNA探针复合物的捕获与去除

A.吸取 RRB（rRNA Removal Beads）至新1.5 mL Nuclease-free离心管中

B.将上步中的RNA/Probe混合物转入RRB中并立即迅速混匀，然后再涡旋混匀，室温孵育5 min

C.孵育结束后再中速涡旋，然后置于磁力架上2 min至上清液澄清

D.转移上清液到新离心管中，补加Nuclease-free Water，置于磁力架上至上清液澄清，转移上清液到新的离心管中

3) rRNA-depleted RNA的纯化及打断

A.向上述反应产物加入相应体积的（1.8X）已混匀的磁珠，混匀，室温孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到磁力架一侧后移弃上清液

B.向反应管中加入新鲜配制的80% ethanol，磁力架上静置30s，移弃上清液，重复该步骤1次

C.打开管盖，空气干燥至磁珠表面无光泽，有细微裂纹，加入Frag/Prime Buffer洗脱，吹吸混匀，室温静置，磁力架上静置，转移至新的Nuclease-free 0.2 mL离心管中，PCR仪高温打断，打断完成后立即放在冰上

3.2合成 cDNA 第一条链

向上步反应的离心管中加入反转录合成所需的试剂1st Strand Buffer 2、1st Strand Enzyme Mix 2及Actinomycin D (5mg/ml)，混匀离心后放入PCR仪中设定好程序进行cDNA第一条链的合成。

3.3合成 cDNA 第二条链（含末端修复及接头连接）

1)向合成的 cDNA 第一条链产物中依次加入二链合成反应的试剂2nd Strand Buffer 2（with dUTP）、2nd Strand Enzyme Super Mix，混匀离心后，放在PCR仪中孵育完成二链的合成

2)运行结束后加入末端修复及接头连接的试剂：Rapid Ligation Buffer 3、Rapid DNA Ligase 2及IDT接头，混匀离心后，放在PCR仪中运行程序

3.4末端修复及 3’-末端加A

向上述纯化产物中加入末修试剂，放入PCR仪中进行反应，反应结束后，立即进行接头连接

3.5连接接头及产物纯化

1)向上述反应产物加入0.9X已混匀的磁珠，混匀，室温孵育而后置于磁力架上，待磁珠吸附到磁力架一侧后移弃上清液

2)离心管置于磁力架上，加新鲜配制的 80% ethanol，静置 30s，移弃上清液

3)重复步骤 2 一次，第二次清洗后离心用 10ul 枪头将上清液去除干净

4)离心管置于磁力架上，打开管盖，空气干燥

5)取下离心管，加入Nuclease-free Water，混匀，室温孵育，而后置于磁力架上静置，吸取上清液转入新的 离心管中

3.6PCR 扩增

向上述离心管中加入 PCR 反应所需的各种试剂，混匀后离心，根据 PCR 反应条件，放入 PCR 仪中进行 PCR 扩增

注意：primer中包含Index序列，使用时需严格按照上机调度安排的序列添加

3.7PCR 产物纯化

1)瞬时离心 PCR 反应管，加入相应体积的磁珠，充分混匀

2)室温孵育，然后置于磁力架上静置，小心移除上清液

3)向反应管中加入新鲜配制的 80% ethanol ，磁力架上静置 30s ，移弃上清液，重复该步骤 1 次

4)打开管盖，磁珠干燥后加入 Nuclease-free Water 洗脱 DNA ，吹吸混匀，室温静置，磁力架上静置，小心 吸取上清至新的离心管中，并分装 1.5 μL 于新的 1.5 mL 离心管中用于片段检测，-20℃保存

3.8文库质检

文库通过 Qsep-400 方法进行质检，满足如下指标即可上机检测：

3.9引物接头序列

adpter3=”AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”;

adpter5=”AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT”;

3.10建库试剂耗材

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)，货号N406-01

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Plant)，货号N409-02

1)文库构建试剂盒

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Human/Mouse/Rat)，货号N406-01

Ribo-off rRNA Depletion Kit(Plant)，货号N409-02

2)产物纯化磁珠

VAHTSTM DNA Clean Beads，货号N411-03

VAHTSTM RNA Clean Beads，货号N412-02

3)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

4)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

3.11建库设备

4、测序方法

测序设备：NovaSeq X plus

测序试剂盒：NovaSeqTM X  Series25B Rgt Kit