ATAC 实验流程材料方法

 

1、提取方法

采用梯度离心的方式提取细胞核，使用Qiagen PCR（28006）纯化试剂盒纯化DNA

1)裂解液配方

A.裂解液1（适用于胚胎等较难裂解的细胞）

10 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 10 mM NaCl， 3 mM MgCl2，0.5% NP-40

Wu J, Xu J, Liu B, et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA[J]. Nature, 2018

B.裂解液2

10 mM Tris·Cl，（pH 7.4），10 mM NaCl，3 mM MgCl2，0.1% (v/v) Igepal CA-630

Buenrostro J, Wu B, Chang H, et al. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide[M]// Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. 2015:21.29.1

C.裂解液3（适用于植物细胞，注意细胞壁的处理）

15mM Tris-HCl pH7.5， 20 mM NaCl， 80 mM KCl， 0.5 mM spermine， 5 mM 2-ME， 0.2% TritonX-100

Lu Z, Hofmeister BT, Vollmers C, et al. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(6)

注：不同的细胞适用的去污剂的类型和浓度有所差异，需要根据自己实验细胞做对应的调整，较强的裂解液会影响调控区域的打开与关闭，裂解强度不够则影响细胞破裂，影响酶进入到细胞核内

2)细胞收集

A.500×g 离心 5 min 收集细胞，弃上清，PBS 将细胞沉淀重悬

B.细胞计数仪计数

C.取含目标细胞数目的单细胞悬液，500×g 离心 5 min 收集细胞，弃上清弃尽上清，用 50 μl 预冷的 Lysis buffer 重悬细胞，冰上放置 10 min 裂解细胞。

D.注：若样本体积在 5ul 以内，可直接加入裂解液裂解细胞

E.在 4℃下，500×g 离心 5 min 收集细胞核

F.弃上清，在下一步实验开始前置于冰上

注：为了防止样本丢失，可在离心时，在细胞聚集的管壁方向做好标记，吸取上清时，在沉淀对立面轻轻吸取液体

2、检测方法

2.1检测方法

取新的1.5ml离心管，加入10ul台盼蓝和10ul样品，枪头吹吸混匀，吸取10ul于细胞计数板上，置于细胞计数仪上进行计数，记录细胞浓度和细胞活性

2.2判定标准

细胞数大于50000个

3、建库方法

3.1DNA的纯化及打断

1)配置打断mix，配制完成后，用200ul枪头吹吸混匀

2)37℃、700rpm金属浴30min

3.2DNA的纯化

1)打断结束后，直接在原管中加入250ul Buffer PB和10ul 3M醋酸钠（PH 5），枪头吹吸混匀

2)将上述溶液全部转移至4℃柱子（4℃保存），室温、13000rpm离心1min

3)弃掉收集液，将柱子放回原管，加入750ul Buffer PE，室温、13000rpm离心1min

4)弃掉收集液，将柱子放回原管，室温、13000rpm离心1min

5)弃掉收集管，将柱子转移到剪掉盖子的1.5ml离心管，打开柱子的盖子，环吸去除柱子底部的剩余PE Buffe

6)加入27ul EB溶液至柱子的中心（即白色滤膜），室温静置1min

7)室温13000rpm离心1min，离心管底部溶液即为提取的DNA

3.3PCR 扩增

配制PCR MIX，所用试剂盒为Vazyme TD202（-20℃保存），将提取的DNA转移至0.2ml PCR管，根据下表配制PCR MIX，配制完成后，用200ul枪头吹吸混匀上述MIX
1)PCR体系

2)PCR程序

注：PCR产物Qubit定量浓度低于10ng/ul，需加扩2个cycle，加扩时，去掉上述PCR程序的第一步

3.4片段筛选及文库纯化

1)将扩增后的PCR体系转移至新的的1.5ml离心管，加入27.5ul XP磁珠，枪头吹吸混匀，室温孵育5min

2)将离心管置于磁力架上，静置5min至液体澄清

3)小心将上清转移到新的1.5ml离心管中

4)向上述离心管中加入50ul XP磁珠，枪头吹吸混匀，室温孵育5min

5)将离心管置于磁力架上，静置5min至液体澄清，弃上清，向离心管中加入200ul 80%乙醇，室温孵育15s，弃上清，重复该步骤一次

6)取下离心管，瞬时离心3s，再次置于磁力架上，用10ul枪头除尽底部残留乙醇

7)打开离心管盖子，晾干磁珠至磁珠表面不反光呈雾面状态即可

8)取下离心管，加入21ul EB，枪头吹吸混匀，室温孵育5min

9)将离心管置于磁力架上，待液体澄清后，取出2ul上清液于新的1.5ml离心管进行2100检测，取出1ul进行Qubit定量

10)吸取所有剩余上清液于新的1.5ml离心管中（离心管盖上标明文库名称、出库日期、INDEX）

3.5文库质检

1)质检方法：文库通过 Qsep-400 进行片段质检， 使用 Qubit 3 .0 进行文库浓度的定量

2)质检标准：库检片段呈Ladder状，第一个主峰在200bp左右，片段无前后拖尾，无接头

3.6引物接头序列

使用TruePrep Index Kit V2 for Illumina构建的DNA文库结构如下：

试剂盒中提供包含8种N5XX以及12种N7XX，可组合成96种不同的双端Index组合，用于高通量测序时区分不同样品。

Index的序列如下表所示

IIIIIIII表示8 bp index序列，测序前根据测序平台在Sample Sheet中输入所使用的Index对应序列

3.7建库试剂耗材

1)文库构建试剂盒：TruePrep® DNA Library Prep Kit V2 for Illumina，货号TD501-TD503

2)接头试剂盒：TruePrep® Index Kit V2 for Illumina，货号TD202

3)产物纯化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 货号N411-03

4)质检使用试剂：Qsep400 标准DNA 卡夹

5)定量使用试剂：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

6)1.5ml离心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul枪头：Axygen

3.8建库设备

4、测序方法

测序设备：NovaSeq X plus

测序试剂盒：NovaSeqTMX  Series25B Rgt Kit