单细胞测序样品准备过程方案及制备方法流程

2.1送样量要求

目前百迈客单细胞产品包含：单细胞转录组、单细胞核转录组、单细胞免疫组库、单细胞ATAC，不同类型单细胞产品具体送样量要求如下表：

2.2样本质量要求

3.1动物单细胞转录组/单细胞免疫组库

3.1.1 新鲜动物组织样本

1）采集前准备：

实验前分别提前24小时4℃预冷4个冰袋，-20℃预冷2个冰袋。

2）组织处理：

A.新鲜组织从活体取下，要求组织量至少为200mg（黄豆粒大小）；

B.去除周围的脂肪、结缔组织或者坏死组织，用预冷的无菌PBS或者生理盐水清洗2遍，清洗掉血水等杂质；

C.将清洗干净的目标组织样本切割成5cm-1cm左右的组织块，尽量不超过1cm，保证组织块能够充分接触组织保存液，完全浸没在组织保存液中，快速转移到解离实验室进行单细胞悬液制备，或者寄送到百迈客实验室进行解离。

3）样本寄送与运输：

A.离心管用Parafilm 封口膜密封好，在每个样品管上清晰、简明地标记样品名称（采用质量较好的油性笔，并避免与乙醇等有机溶剂接触），样品名称请避免出现汉字，采用字母和数字表示，长度控制在8个字符以内；

B.样本管用气泡膜或纱布包裹，避免样品管直接接触冰袋而导致组织冰冻而坏死，请根据运输时间确认冰袋的数量，确保样本运输到达目的地时，样本温度保持在2-8℃。

4）注意事项：

A.取样时用无菌手术刀或剪刀进行取样，如必须用电刀取样请避免电刀灼烧部位，取样避免坏死部位，取样不能有血凝块；

B.公司承接样本及样本注意事项详情请见”单细胞（核）物种组织白名单”。

C.采样前可以提前联系百迈客当地销售经理获取组织保护液，由百迈客实验室寄送分装好的组织保存液（美天旎，货号130-100-008），组织保护液在2-8℃保存，不建议过多囤放以防滋生细菌，使用前观察试剂状态是否为无色透明液体，无沉淀、无异样；

D.组织在组织保护液中的最佳储存时间为48h，可维持组织样本的细胞活性及完整细胞表位，具体操作方法可参考《百迈客组织保存液寄样指南》视频，可以联系百迈客当地销售经理获取。

送样不规范示例：

A.样本没有纱布包裹，与冰袋直接接触，导致样本结冰，解离活率不足；

B.组织太多，占满整个管子，组织与保护液接触面积很少，使保护液无法有效的保持组织活性；

C.样本结冰，组织被完全冻住，解离活率很低；

D.未将管口包裹住，样本运输过程中管口打开，保护液和部分组织洒落在管外。

3.1.2 血液样本

1）样本采集：

A.采集新鲜外周血至少3mL，迅速置于EDTA抗凝管（紫色）中保存，取样完成后需要立即轻柔管上下颠倒采血管4-6次，保证EDTA抗凝效果；

B.4℃、24h内转移到实验室，分离PBMC后进行后续实验；

C.或者利用淋巴细胞分离液分选出外周血单核细胞PBMC（分选步骤可参考第3.2部分），加入细胞冻存液梯度冻存，具体操作见第3.1.3部分（推荐上门服务）；

2）样本寄送与运输：

A.离心管用Parafilm 封口膜密封好，在每个样品管上清晰、简明地标记样品名称（采用质量较好的油性笔，并避免与乙醇等有机溶剂接触），样品名称请避免出现汉字，采用字母和数字表示，长度控制在8个字符以内；

B.样本管用气泡膜包裹，避免样品管直接接触冰袋而导致组织冰冻而坏死，请根据运输时间确认冰袋的数量，确保样本运输到达目的地时，样本温度保持在2-8℃。

3）注意事项：

A.取样前需要确认EDTA抗凝管在保质期范围内，只能用EDTA紫色抗凝管；

B.百迈客可以提供PBMC分离服务；

C.血液离体时间不超过24h。

3.1.3 PBMC/细胞悬液样本

PBMC样本与细胞悬液样本，如果没有预约上门服务，需要按细胞梯度冻存的方式冻存起来，干冰寄送，细胞梯度冻存操作步骤如下：

A.冻存前准备：提前30min从-80℃冰箱取出梯度降温盒并恢复至室温备用；

B.准备好900μL血清+100μL DMSO的细胞冻存液；

C.收集PBMC或细胞，用预冷的无菌PBS清洗1-2遍，将配好的冻存液进行细胞重悬；

D.将重悬好的细胞悬液分装到细胞冻存管中，并在冻存管侧壁做好标记；

E.将冻存管放入梯度降温盒中，放入-80℃冰箱，冻存的细胞在梯度降温盒中放置24h后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上进行冷冻运输，寄送到百迈客实验室。

3.1.4 穿刺样本

1）样本采集：对于穿刺样本，在采集样本过程中，使用粗针(穿刺针管外径≥1.2mm)穿刺采集3条样本。

2）注意事项：

A.组织处理、样本寄送与运输参考第1.1部分；

B.采集时需注意的是不能用真空针采样；

C.穿刺样品量较少，建议送样量≥3条，通过增加穿刺样本数可以提高成功率。

3.2 动物单细胞核转录组/单细胞ATAC

3.2.1 冷冻组织样品

1）样本采集与寄送：

A.新鲜组织从活体取下，要求组织量至少为250mg；

B.去除周围的脂肪、结缔组织或者坏死组织，用预冷的无菌PBS或者生理盐水清洗2遍，清洗掉血水等杂质，并用纱布或无尘纸擦干组织表面水分；

C.将清洗干净的目标组织样本切割成5cm-1cm左右的组织块，尽量不超过1cm，组织分成两份，一份150mg，一份100mg并做区分标记，分别转入两个冻存管中，150mg提取细胞核，100mg提取质检RNA（要求 RIN≥6.0）；

D.立即液氮速冻30min以上，再转移到-80℃保存或干冰寄送，确保组织寄送到实验室后为冷冻状态。

2）注意事项：

心脏、肌肉、皮肤、肺癌、子宫、病变纤维化和器官硬化类组织，提核后会产生较多的碎片，需要进行流式分选去碎片；如果涉及到以上样本，请送样前提前告知，以便开始提核实验前预约好流式细胞仪，以免耽误实验进度。

3.2.2 冻存细胞样本

1）冻存前细胞质检：冻存前对细胞质量进行检测，要求细胞活性大于90%、细胞结团率小于 10%，样品无细胞碎片等杂质；原代细胞或培养细胞总数大于1×10⁶个，流式分选细胞大于5×10⁵个，并提供质检结果。

2）细胞梯度冻存：

A.冻存前准备：提前30min从-80℃冰箱取出梯度降温盒并恢复至室温备用；

B.准备好900μL血清+100μL DMSO的细胞冻存液；

C.收集PBMC或细胞，用预冷的无菌PBS清洗1-2遍，将配好的冻存液进行细胞重悬；

D.将重悬好的细胞悬液分装到细胞冻存管中，并在冻存管侧壁做好标记；

E.将冻存管放入梯度降温盒中，放入-80℃冰箱，冻存的细胞在梯度降温盒中放置24h后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上进行冷冻运输，寄送到百迈客实验室。

3.2.3 其他类

血液样本参考第3.1.2部分，PBMC/细胞悬液样本参考第3.1.3部分，推荐直接上门服务。

3.3 植物单细胞核转录组

3.3.1 新鲜植物组织样品

1）活体植株（优先推荐）

A.幼嫩植株：种子培育的低龄幼苗（7-14 天）、组培苗——叶片、幼嫩茎、茎尖、根尖；

B.成熟植株：茎尖组织及靠近茎尖的第 1-2片幼嫩叶片、发育中的花或者花序；

C.取样量：保证每一个单细胞核转录组文库的理论用量 0.5-2g；

D.其它：特殊贵重活体样品需要客户提供样品的种植、保存条件（温度、光照、营养液、浇水条件、PH 等等），以保证样品的正常生长；

E.每一个根部保留少量土壤，利用锡箔纸或者塑料薄膜将植株根部包裹起来， 植株部分需要利用小铁环或者丝带缠绕，保证枝条茎叶不分散，但不需要捆绑非常紧实，防止机械对茎枝叶的损伤。

F.外面用纸箱或者泡沫包裹，防止植株碰撞，并用塑料薄膜缠绕固定。

G.一般活体植株常温运输培养，如果有特殊培养条件（需要做相应的处理，例如，低温用冰袋运输，冰袋与密封袋之间放置泡沫板）。

2）离体枝条

A.枝条选择：枝条顶端有待萌发叶芽，且叶芽周边有几片幼叶；枝条中下端保留部分成熟叶片；

B.枝条预处理：剪断枝条，自底端往上约5cm 用浸透水的吸水纸包裹好，放入自封袋，袋中喷水，填充部分空气，密封袋口；

C.枝条运输：自封袋放入泡沫箱，箱体内侧壁放部分冰袋（保证低温运输），冰袋与自封袋间放置泡沫板，防止冰袋积压样品或因冰袋与样品直接接触导致样品被冻伤；

D.运输时间：保证24 h内到样，最多不得超过48 h；

E.取样量：保证每一个单细胞核转录组文库的理论用量 0.5-2g；

F.其它：取“离体枝条”仅限比较难以获得幼嫩活体植株的项目，如野外采样、植株过大等导致的取样或运输比较困难的项目；离体枝条到样后如有损伤等将不再用于实验；离体枝条如果保存、运输不善会存在部分潜在风险：即得到的实验效果可能会比活体植株检测结果稍差（理论上的潜在风险）。

3）注意事项

A.建议一次送样量≥2g；

B.所有待取的幼嫩组织长势必须正常（无病虫害、无营养缺失）；

C.对于需要保留茎尖的特殊情况，取样时不取茎尖组织，只取紧靠近茎尖的第 1-2 片嫩叶；

D.部分植物单细胞核项目（物种及组织类型在我司白名单之外）在正式启动前会进行预实验以判断能否顺利开展正式实验，故活体样本送样时应保证至少3天的启动延时（即活体样本到样后需等待3天至预实验合格后方能正式启动样本，如对时期要求严格的样本需格外注意），送样前可与我司沟通确认具体情况。

3.3.2 冷冻组织样品

1）样本采集与寄送：

A.新鲜组织从活体取下，要求组织量至少为700 mg；

B.去除周围的非目标组织，用预冷的无菌PBS或者生理盐水清洗2遍，清洗掉杂质；

C.将清洗干净的目标组织样本切割成0.5cm-1cm左右的组织块，尽量不超过1cm，剪切成约0.5 cm,不足0.5 cm的从中间切开即可；

D.将组织分成两份，一份600mg，一份100mg并做区分标记，其中600 mg用来提取细胞核，100 mg用来提取 RNA（要求 RIN≥7.0）；

E.立即液氮速冻30min以上，再转移到-80℃保存或干冰寄送，确保组织寄送到实验室后为冷冻状态。

4.1 悬液制备方案评估

由于不同物种和组织类型的解离条件差异较大，百迈客提供单细胞悬液制备预实验服务，会对目标组织类型的单细胞悬液制备方案进行评估。提前预约好样本寄送时间，保证到样后尽快开展单细胞悬液制备实验，组织冻存液寄送样本最好在48h内完成解离；确定好细胞悬液制备方案后，即可正式开展项目。

4.2 正式实验

目前百迈客提供两种类型的正式实验服务模式：

4.2.1 上门服务

老师只需提供组织样本，预约上门后实验工程师上门，按照预实验评估的解离方案进行解离、单细胞分选上机、反转录成cDNA后低温暂存，后续在百迈客实验室完成建库测序。

或者老师完成单细胞悬液制备实验，实验工程师进行单细胞悬液质量评估，评估合格后进行后续实验操作，单细胞质量要求见第2.2部分。

备注：单细胞悬液制备好后，建议在30分钟内质检上机，建议老师提前安排好时间；仪器设备要求详情见第4.3.3部分。

4.2.2 组织寄送

百迈客单细胞组织保存液寄送方式（推荐），采用组织保存液储存组织样本，既可以保持样本最原始组织活性状态，又可以解决样本难以获取以及批次性效应等问题，老师寄送组织到百迈客实验室，实验工程师进行解离、单细胞分选上机、反转录、建库、测序。

注意事项

• 根据组织类型选择服务模式：适用于组织保存液寄送的组织推荐组织，寄送，其他不适用寄送的组织类型、细胞、血液样本推荐上门服务；
• 一些特殊样本由于组织结构、细胞大小等限制，在不适用单细胞转录组测序的情况下，可以进行单细胞核转录组测序。

4.2.3 仪器耗材清单

注意事项：

1）标记*的设备需放置在同一房间；

2）实验台大小要求能满足两名实验员操作；

3）三孔仪器电源插座大于3 个；

4）生物安全柜可用常规实验台代替。

4.3 风险提示与评估

1）组织保存液寄送样本尽量保证48h内寄送到实验室开展实验，时间过长会影响细胞活率及细胞表达状态；

2）单细胞核转录组组织样本一定要备份进行质检（RIN值≥6.0），RNA完整性会影响数据结果；

3）细胞活率低于85%，可能引起mRNA部分降解导致基因检出减少，细胞内线粒体基因比例偏高，占用有效数据量；

4）细胞直径<40 μm（10x）或<60 μm（DG）细胞过大容易堵塞芯片，无法形成油包水，过大的细胞利用细胞筛过滤；

5）细胞结团<15%，组织解离不充分，会看到细胞悬液中2个或多个细胞粘连在一起的情况，可能会导致最终数据中双细胞占比偏多，占用有效数据量，结团过高还可能会堵塞芯片，无法形成油包水；

6）解离过程中可能由于解离条件过于剧烈而产生大量碎片，可能会导致背景噪音高，占用有效数据量，也会引起有效细胞数偏离预期。