对于高通量技术大家一定都不陌生，但生物信息分析之后该做什么呢？本文和大家探讨并分享高通量测序后的实验验证，即该用什么技术做什么验证！
先和大家探讨最常见的转录组测序后的验证方法。转录组的验证方法有点多（如表达量验证、亚细胞定位、RNA结合蛋白、功能获得验证、功能缺失验证等），本篇只先介绍表达量验证、RNA结合蛋白、亚细胞定位，其余的下期见！
表达量验证
一般情况我们优先选择高表达量的RNA，以及差异表达明显的RNA去验证。去验证某个基因或者RNA的表达量时，需要保证没有基因组DNA的污染。PS:如果是非编码RNA验证，由于他们可能不含polyA尾巴，所以要注意反转录方式。
设计引物RNA进行qRT-PCR。
哈哈哈，如果你和小编一样曾是生信dog，我相信你一定一脸懵逼，我连PCR到底是啥能干啥都不知道，你跟我说qRT-PCR!
小编以一个实验编外人士跟你通俗易懂的科普一下，PCR是设计引物判断某个DNA序列是否存在的技术；RT-PCR对RNA进行反转录（Reverse transcription）得到cDNA后，以cDNA为模板进行PCR反应，进而判断某个RNA序列是否存在的技术；qPCR不只判断DNA是否存在，还能判断含量高低，qRT-PCR即quatitative RT-PCR，是判断RNA是否存在以及含量高低的技术！
总结一句话，PCR都得设计引物，带RT就是研究RNA,不带RT就是研究DNA，带q就是定量，不带q就是定性！至于他是咋定量的呢，划重点，靠内参！！
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。PS: Northern blot样品需除去RNA酶。
小编再给大家科普一下下，Western Blot做蛋白，Southern Blot做DNA，Eastern blotting是Western Blot的变形也是作蛋白，不过没得到广泛认可。
灵敏度：qRT-PCR > Northern blot
特异性：Northern blot > qRT-PCR
RNA和蛋白互作验证
RNA结合蛋白（RNA Binding Protein）是一类伴随RNA的调控代谢过程，与RNA结合的蛋白质的总称。RBP伴随RNA生命始终，其主要作用是介导RNA的成熟、转运、定位和翻译；一个RBP可能存在多种靶标RNA；且其表达缺陷会造成多种疾病。RNA与蛋白相互作用是RNA功能研究的焦点问题之一。
已知RNA，寻找结合蛋白。
RNA pull-down实验就是先将RNA进行标记（如生物素探针标记）再与蛋白共同孵育，从而形成RNA-蛋白质复合物，通过SDS-PAGE分离蛋白质，最后通过WB(western blot)或质谱（mass Spectrometry）检测蛋白质。
该技术用于寻找与目的RNA结合的蛋白。
已知蛋白，寻找RNA。
RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀）技术采用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经分离纯化对RNA进行分析。
该技术用于寻找与目的蛋白结合的RNA。
已知RNA,已知蛋白，判断是否结合。
EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，凝胶迁移）技术是通过凝胶电泳迁移检测蛋白-RNA互作的一种技术。
首先将设计好的带有标记的RNA探针与样本蛋白混合孵育，形成蛋白-RNA复合物。因复合物分子量大，会在聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，来确定RNA结合蛋白的特异性。
该技术用于体外验证预测的RNA与蛋白之间是否能够结合。
亚细胞定位研究
亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位，例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。越来越多的证据显示，在生物学过程中位于不同的亚细胞器RNA拥有不同的功能，亚细胞定位有利于更深入地了解RNA的生物功能。
RNAFISH
RNAFISH，即RNA的免疫荧光原位杂交，是将已标记的RNA探针（可在探针上标记荧光基团、生物素、地高辛等）与组织切片或细胞中的待测RNA中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的RNA进行定性、定位和相对定量分析。
数据库
偷偷的告诉你，RNALocate数据库（http://www.rna-society.org/rnalocate）收录了超过42,000个人工收集的RNA的亚细胞定位信息，包含超过23,100个RNA，在65个物种中的42个亚细胞定位。lncATLAS数据库（http://lncatlas.crg.eu/）则是一个专门收录lncRNA亚细胞定位的数据库。有需要的可以先去查询！
参考文献：
Zhang T , Tan P , Wang L , et al. RNALocate: A resource for RNA subcellular localizations[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(Database issue).Mas-Ponte D, Carlevaro-Fita J, Palumbo E, Pulido TH, Guigo R, Johnson R. LncATLAS database for subcellular localization of long noncoding RNAs. Rna. 2017 Jul 1;23(7):1080-7.
如果您的项目有任何问题，欢迎点击下方按钮联系我们，我们将免费为您设计文章方案。
京公网安备 11011302003368号