英文名称: Comprehensive approaches reveal key transcripts and metabolites highlighting metabolic diversity among three oriental tobacco varieties
中文名称: 综合方法揭示了三种东方烟草品种中突出代谢多样性的关键转录本和代谢物
杂志:Industrial Crops & Products 2020
影响因子: 4.244
研究背景
烟草(Nicotiana tabacum L.)是一种商业上重要的农作物,在 12 个欧洲联盟(欧盟)国家种植面积约 10 万公顷,每年生产 20 万吨干叶(欧洲联盟委员会,2015 年)。希腊是欧洲第二大烟草生产的国家。在希腊栽培的烟草品种主要是东方烟(晒干)品种,主要特点是小的植株和叶片大小以及其独特的芳香性。“Xanthi 81”, “Katerini 53”和“Smirni 3B”这三个品种的特点是它们的性质不同,特别是它们的香气和风味。对这三个品种的转录组学和代谢组学数据的整合提供了对可能影响重要烟草特征的遗传背景的深入了解,并显示了操纵这些途径用于育种或生物技术目的的潜力。
材料方法
1、 实验材料:“Xanthi 81”, “Katerini 53” 和 “Smirni 3B”
2、 研究方法:转录组;代谢组。
研究结果
1. 转录组分析
1.1“ Xanthi 81”和“ Katerini 53”中的差异表达(FPKM> 1)
基因在“ Xanthi 81”和“ Katerini 53”之间表达差异较大的基因为Nitab4.5_0000194g0060,该基因在“ Katerini 53”中的表达比“ Xanthi 81”高13.4 倍。与“Xanthi 81”相比,该基因在“ Katerini 53”中上调的事实表明,该品种可能具有多种反应机制。在两个品种之间差异表达的另一个烟草基因 Nitab4.5_0000194g0070,推测其可能编码另一个 T-叶绿素蛋白,但转录本似乎带有终止密码子,并且与 T-叶绿素 2b 不同(GenBank:BAJ25790.1)。两个品种之间的第三大差异基因是编码脂肪氧化酶的基因 Nitab4.5_0002164g0020。与编码细胞溶解酶受体激酶 5(LYK5)的“ Xanthi 81”相比,“ Katerini 53”中的 Ni-tab4.5_0000525g0010 也显著上调。最后一个基因是 Nitab4.5_0000363g0260;BLAST 结果表明被翻译成 CP12-1 蛋白参与Calvin-Benson 循环。在烟草中,反义抑制 CP12 的表达对光合作用本身没有很大影响。但是,反义表达载体的转基因烟草的表型显示出异常的叶片形态,生长,矮化和顶端优势减少。对这些烟草进行的进一步的转录组学分析发现,基因表达发生了轻微变化,但某些初级代谢酶,对胁迫做出响应的基因以及参与多胺代谢的基因发生了显著变化,所有这些都表明 CP12 蛋白的作用更为复杂。
1.2. “ Xanthi 81”和“ Smirni 3B”中的差异表达(FPKM> 1)基因
与“ Xanthi 81”相比,“ Smirni 3B”和“ Katerini 53”中存在三种常见的过表达基因。除了 Nitab4.5_0001847g0020.1,另外两个分别为编码 LOX 2.1 和 CP12-1 蛋白质的 Nitab4.5_0002164g0020.1 和 Nitab4.5_0000363g0260.1。烟草的CP12-1 同源物在两者之间表达最多,在“Smirni3B”和“Katerini53”两个品种中的表达值相同(199.9 vs 198),这表明 CP12 在“Xanthi 81”中低水平表达。目前烟草品种之间 CP12 的表达差异可能反映了生产力,植物防御力或任何其它尚未确定的途径的差异,这些来可能对烟草育种产生巨大影响。
在 “Xanthi 81” 和 “Smirrni 3B” 之间差异表达大的一个基因是Nitab4.5_0000200g0190.1。推测参与 HGL-DTGs 生物合成相关。HGL-DTG 是非常重要的二萜,在几种茄科物种中大量产生。与被抑制(FPKM = 13.6)的“ Xanthi 81”相比,该基因主要在“ Katerini 53”(FPKM = 80)和“ Smirrni 3B”(FPKM = 76.1)两个品种中高表达。同时,在“ Katerini 53”和“ Smirrni 3B”中也显著诱导了产生香叶基香叶基二磷酸(焦磷酸)(GGPP)的基因的同系物,GGPP是 HGL-DTG 生物合成的前体。共检测到了三种 GGPP 合成酶。GGPPS1 主要在“ Katerini 53”(FPKM = 82.9)和“ Smirrni 3B”(FPKM = 89.3)表达,而在“ Xanthi 81”(FPKM = 40.6)中较低的表达。第二个几乎在所有三个品种中平均表达,而第三个几乎不表达。品种之间的这种差异可表明萜类化合物的产量存在差异。然而,在这项研究中,作者没有关注生产的萜类。
2.GO 富集分析
对差异表达的基因进行 GO 富集分析。在生物过程类别中,主要与超氧化物酶代谢,精氨酸分解代谢,苹果酸代谢和多胺生物合成有关。分子功能类别中的富集类别为硫氧还蛋白活性,固醇结合,L-苏氨酸氨裂解酶活性和富马酰乙酰乙酸酶活性。在细胞成分类别中,主要为高尔基体堆积,小亚基加工体,细胞外间隙和 1,3-β-D-葡聚糖合酶复合体。
3.苯丙素生物合成
在大多数植物中,苯丙烷的生物合成从 L-苯丙氨酸转化为肉桂酸酯(或肉桂酸)开始,并形成多种多酚。其中有四分之二的在所有品种的叶片中均高表达,剩余的则表达较少。PAL1(Ni-tab4.5_0000754g0260.1)在所有品种中表达最高,其次是 PAL4(Nitab4.5_0000101g0270.1)。与其它两个品种的叶子相比,在“ Katerini 53”中两个 PAL 基因都检测到高表达。而在结果中仅发现了一个低丰度肉桂酸基因(C4H),而该基因在“Katerini 53”中仍被上调。另一方面,有多个 CoA-连接酶(4CL)基因,除了其中两个外,大多数基因低表达。Ni-tab4.5_0002394g0060.1 和 Nitab4.5_0001842g0060.1 在“Xanthi 81”叶片中均上调。这两个基因可能是两个不同的等位基因,因为它们与同一基因具有高度同源性(NCBI 基因 ID:107783543,草酸-CoA 连接酶类似)。这些基因有助于将苯丙氨酸转化为 4-香豆基辅酶 A,这是一种重要的中间体,可作为下游许多产物合成的前体。HCT/HQT 和 C3H 这两个基因参与了 CGA 的合成。在结果中后者几乎没有表达。但检测到 3 个高表达的 HCT/HQT。其中两个(Nitab4.5_0002724g0070.1 和 Nitab4.5_0002320g0020.1)是烟草 hqt 基因的不同等位基因(NCBI:NP_001312079)。两者在“Xanthi 83”中均被上调。HQT优选结合奎宁酸酯而不是草莽酸以产生 CGA。本氏烟草中 HQT 基因的过表达显著提高了 CGA 的产量。第三个为 Nitab4.5_0001271g0010.1 是从烟草茎中纯化的 HCT 基因(NCBI:NP_001312552),被发现可催化 CGA 和木质素的合成,但是,该基因表达不足,品种间没有明显差异。
3.1.黄酮醇
查尔酮合酶(CHS)是类黄酮生物合成中的关键酶。研究者发现两个 CHS基因在三个烟草品种的叶片中均低表达,因为 CHS 主要在花中组成性表达,但其表达主要是由非生物/生物胁迫诱导的。注释为 CHS-1B 或 CHS2 的Nitab4.5_0002920g0060.1 在’Katerini 53’和’Xanthi 81’中略有上调,但第二个注释为 III 型聚酮化合物合酶(NCBI:XP_016446648.1)差异很小。所有 CHI 基因也仅以低水平表达,在鉴定的结果中 F3H 也没有差异。另一方面,鉴定了两个参与黄酮醇形成的 FLS 基因。FLS1(Nitab4.5_0005357g0020.1)(NCBI:LOC107794305)的表达最高,而 NtFLS(Ni-tab4.5_0006276g0010.1)的表达低得多。这两个基因在品种之间没有差异表达。还检测到有助于花色苷生物合成的基因,例如 DFR 和 ANS。DFR 中第一个仅适度表达,另外一个没有差异。ANS(Nitab4.5_0003274g0110.1)几乎未表达(图 2)。芦丁是一种黄酮醇糖苷,在花青素途径生物合成,其中包括黄酮醇 3-O-葡萄糖基转移酶和黄酮醇 3-O-葡萄糖苷胰岛素转移酶。结果表明低表达的 4 种黄酮醇 3-O-糖基转移酶和 2种黄酮醇 3-O-糖苷胰岛素转移酶在“Smirrni 3B”和“Xanthi 81”比“Katerini 53”中表达更高、更多。
研究结果表明,在两个 PAL 基因的表达中检测到品种之间的显株差异。与其它两个基因相比,“Xanthi 81”中的基因表达不足,这可能意味着该品种中向CGA 的苯基-丙烷途径的产物通量不同,因为当烟草中 PAL 过度表达时,PAL 活性及其含量显著更高,其后的 CGA 浓度比芦丁更高,这意味着更多的产物被转移至该选择性途径。具有显著较高的 CGA 含量的烟草植物中 PAL 含量的升高也与真菌感染的易感性降低有关。
4.代谢组分析
采集“Katerini 53”,“Xanthi 81”和“Smirrni 3B”叶片样品,并使用气相色谱GC-MS 和 LC-MS / MS 方法进行代谢分析。基因型预先鉴定为不同的色谱模式,共有 78 种代谢化合物(包括糖,氨基酸,有机酸)差异积累,如图 3 所示。详细的非靶向 GC-MS 代谢组学分析用于鉴定烟叶中产生的大多数主要代谢产物。在本研究中,所测得的最丰富的可溶性糖是果糖,葡萄糖,半乳糖和蔗糖。在果糖和蔗糖中检测到统计学差异;“Katerini 53”中的果糖含量更高,而“Smierni 3B”中的蔗糖含量更高。“Katerini 53”与其它两个品种相比葡萄糖和半乳糖水平较高,差异无统计学意义。在可溶性醇中,两个丰富的代谢产物是山梨糖醇和肌醇,但在品种之间未检测到统计学上的显著差异。这三个品种中的苹果酸含量没有任何统计上显著不同。“Xanthi 81”叶子的氨基酸含量最高,但谷氨酸和 γ-氨基丁酸(GABA)除外。GABA 和脯氨酸是烟叶中的主要氨基酸。与其他两个品种相比,“Smirrni 3B”中的 GABA 水平明显更高。’Smirrni 3B’和’Xanthi 81’中的脯氨酸水平较高,而“Katerini 53”的脯氨酸水平最低。在“Smirrni 3B”中检测到了高浓度的甘氨酸和丝氨酸这两种必需氨基酸。烟草生物碱在根部合成,然后转运到叶片。生物碱、尼古丁与植物抗草食动物防御有关。在三个品种中检测到的尼古丁浓度在统计学上有显著差异。结果表明,“Xanthi 81”的尼古丁浓度最高,而“Smirrni 3B”的尼古丁浓度最低。与“Katerini 53”相比,“Xanthi 81”中腐胺的含量有所降低,但其浓度仍高于“Smirrni 3B”。鉴定了所有拟参与烟草中尼古丁生物合成的相应基因,但仅发现少数几个在成熟叶片中表达。然而,基因 XS 和 QPT(三分之二)在“Xanthi 81”中表达较高。与其它两个品种相比,这与“Xanthi 81”叶片中较高的尼古丁含量相关,这表明它可能是遗传控制的。
总体而言,烟草多酚在这三个品种中差异很大。对数据进行统计分析,结果表明在三个品种之间多酚成分的含量存在显著差异。“Katerini 53”的 CGA,5-CGA 和 4-CGA 含量显著更高,尽管对于后者的化合物,仅与“Smirni 3B”相比,差异才具有统计学意义。
如上所述,“Xanthi 81”中两个 HCT/HQT 基因高表达,但与“Katerini 53”相比,其叶片中的 CGA 浓度较低。另一方面,HCT/HQT 基因的高表达可能由于前体的限制而导致更多的产物形成。“Xanthi 81”和“Smirrni 3B”中的香豆素衍生物,瑞香碱和莨菪碱等被下调。两类主要的类黄酮,即黄酮和类黄酮,起着保护细胞免受 UVeB 辐射的作用,因为它们聚集在叶片的表皮层中,并在 UVeB 区域强烈吸收光。NAR 是一种黄烷酮,是所有下游类黄酮类(包括黄酮醇)的前体。“Smirni 3B”中 NAR 比“Xanthi 81”高出四倍。香草醛,一种低分子量的酚类化合物,具有抗氧化和抗微生物特性。在“Smirni 3B”中发现了高含量的香草酸和香草醛,分别比其它品种含量高 3.5 倍和 4.26 倍。先前的研究表明,HCHL 基因的转基因烟草品系显示 CGA 和芦丁的消耗高达 93%和 82%,而以前无法检测到的香草酸和香草醇的含量却上升了。与这些结果相吻合的是,“Smirni 3B”中的香草醛和香草酸含量高,而 CGA,东莨菪素和芦丁含量低。此外,“Smirni 3B”的咖啡酸含量比“Katerini 53”高 3 倍,并且含量也高于“Xanthi 81”,这些差异具有统计学意义。“Xanthi 81”中的芦丁浓度较高,但仅与’Smirni 3B’相比具有统计学意义,在‘Katerini53’叶提取物中,主要的香豆素-东莨菪碱积累量较大。在三个品种中似乎仅黄素醇-3-O-葡糖苷胰岛素转移酶差异表达,这可能与仅在“Xanthi 81”和“Smirni 3B”中芦丁各自浓度的差异有关。烟碱在“Xanthi 81”中检出的浓度较高,但与其他两个品种没有显著差异。