SDG（开环异落叶松脂素）的次生代谢物途径触发活性氧清除系统来响应棉花Ca2+胁迫

中文题目：SDG（开环异落叶松脂素）的次生代谢物途径触发活性氧清除系统来响应棉花 Ca 2+胁迫

英文题目：Secondary metabolite pathway of SDG(secoisolariciresinol) was observed to trigger ROS scavenging system in response to Ca stress in cotton.

背景与内容

钙是植物生长发育所必需的营养素，它不仅在植物细胞膜和细胞壁中的结构物质，而且作为第二信使介导细胞内信号转导。虽然人们对Ca2+在缓解植物各种生物和非生物胁迫中的作用及其调控机制进行了深入的研究，但棉花适应高Ca2+胁迫的分子机制仍不清楚。我国棉花种质资源丰富，分布广泛，但我国种植的主要棉花种质均不耐钙。因此，从耐钙品种中挖掘相关的耐钙基因，揭示耐钙机制，对于培育高产耐钙材料具有重要意义。

本研究对103份棉花材料在200mMCaCl2胁迫下萌发，从103份棉花材料中筛选出一个极端抗Ca2+基因型（中9807，R）和一个Ca2+敏感基因型（CRI50，S）。然后将这两份材料分别在0mMCaCl2和200mMCaCl2中发芽5天，然后取样进行转录组测序。形态学和生理学分析表明，在R中特异表达的PLR2可能通过促进SDG的合成来增强棉花清除活性氧的能力。综上所述，本研究提出了棉花应对高钙胁迫的适应机制，有助于提高棉花的抗逆性。

实验材料与方法

1、CaCl2浓度筛选

在103份棉花材料的子叶期用不同浓度的CaCl（20mM、100mM、200mM、300mM、400mM和500mM）处理耐盐棉花材料zhong9807，以0mMCaCl2处理为对照。

2、棉花材料

在本研究中，四个棉花品种的103份棉花材料在萌发期间受到200mMCaCl2胁迫。根据发芽情况，分别选择了1份耐CaCl2胁迫的棉花品种（zhong9807，R）和1份对CaCl2胁迫敏感的品种（CRI50，S）。

3、转录组测序

用0mMCaCl2和200mMCaCl2胁迫棉籽发芽。将种子置于25℃的人工培养箱中，黑暗培养5天，收集萌发期的全株样品，每个样品重复三次。所有单个样品放于−80◦，用于生理测量和转录组分析。转录组分组情况：高抗性棉花（zhong9807，R）对照组RCK与实验组RCa；敏感棉花（CRI50，S）对照组SCK和实验组SCa。

4、qRTPCR分析

从CaCl2胁迫处理后的zhong9807（R）和CRI50（S）转录组中，随机选择20个差异基因进行qRTPCR验证，最后分析qRT-PCR与RNA-seq的相关性。

结果与讨论

1、ABA信号与Ca2+信号联合缓解棉花高Ca2+胁迫

植物在受到非生物胁迫时，其细胞中的ABA会显著增加，细胞质中的Ca2+也会显著增加，最后表皮细胞气孔关闭和核转录反应伴随信号传递发生。在本研究结果中，高Ca2+胁迫后，2个编码钙调磷酸酶B样蛋白（CBL）的基因、8个编码CBL相互作用蛋白激酶（CIPK）的基因和4个编码钙依赖性蛋白激酶（CDPK）的基因的表达水增加。CBL、CIPK和CDPK是ABA信号转导途径的关键基因，可感知与ABA相关的Ca2+浓度增加。CDPKs或CBL/CIPKs结合复合物随后特异性调节下游靶点，包括ABA反应元件（ABRE）和ABRE结合因子（ABF）。在R和S上调的基因中，分别鉴定了10个和百迈客生物科技8个编码ABA反应元件结合因子的基因。大多数基因编码相同的元件，如ABF2、ABI5、DPBF2，但R的ABF3和DPBF3基因比S的多。研究表明，ABF2和ABF3不仅由ABA诱导，而且还由渗透胁迫（如高盐浓度和脱水）诱导。同时，DPBF3可以与ADF5的启动子结合，ADF5的转录被ABA反应元件激活。因此，在高Ca2+胁迫下，R的萎蔫程度比S轻，部分原因可能是ABA信号控制表皮细胞的气孔关闭，减少水分损失，使植物保持直立。

2、通道蛋白参与离子和水平衡调节

通道蛋白AQPs可以形成一个促进水运输所需的水特异性通道，从而提高了植物在各种非生物胁迫下的适应性。差异基因富集分析发现，R组中18个上调的DGEs在通道活性途径（GO:0015267）显著富集，其中16个基因编码水通道蛋白（AQP），在S组中，13个上调的DGEs在通道活性途径（GO:0015267）显著富集，12个基因编码AQP。基于前期研究，作者假设PIP2–2缓解了Ca2+胁迫，可能是因为细胞表皮上的水通道可以吸收细胞间隙的水分，这有利于维持棉花的原始含水量。如果细胞内的水也可以通过PIP2–2从细胞内输送到细胞外，这可能是棉花R中Ca2+胁迫耐受的主要原因。在高Ca2+胁迫下，当细胞质Ca2+浓度增加时，PIP2–8将钠或钾运输出细胞，并有助于维持细胞内Ca2+平衡。因此，本研究推测PIP2–8和PIP2–2对植物耐高Ca2+胁迫的作用相同，它们都可以通过缓解渗透胁迫来提高棉花对高Ca2+胁迫的耐受性。同时，作者还发现，高Ca2+胁迫后，R和S的shaker型K通道基因（SKOR）的表达水平上调，但该基因在S中的表达高于在R中的表达，推测SKOR编码的钾通道可能不是缓解R中高Ca2+胁迫的关键途径。

3、高Ca2+胁迫下的Ca2+信号主要由CML蛋白介导

在非生物胁迫下，不同的Ca2+调节蛋白会对不同的胁迫作出反应。在本研究中，高Ca2+胁迫下，Ca2+信号主要由CMLs、CBLs和CPKsCa2+感受器介导。此外，在R组上调的基因中，编码这三种类型的基因分别为9、2和4个，其中编码CML的基因数量最多。编码CML的9个基因编码不同类型的CML，其中CML10、CML21和CML22为R特异性表达，CML8和CML41为S特异性表达。然而，在转录组R和S中的DEGs中没有CaM相关基因。因此，我们推测CML是应对高Ca2+应激的主要Ca2+感受器。结果表明，在高Ca2+胁迫下，R可以通过提高CML的活性来清除植物体内产生的ROS，从而提高棉花对高Ca2+胁迫的耐受性。

4、SDG的合成增强了棉花清除活性氧的功能

高Ca2+处理后，R组中存在一个特殊的KEGG途径，即生物合成各种次级代谢产物-第2部分（KEGG:ko00998），它可以合成SDG，而SDG是植物中具有抗氧化活性的次生代谢产物，其在植物中的抗性机制尚不清楚。之前研究表明PLR1参与SDG的合成，且其启动子与ABA转录激活调节有关。因此，ABA可以通过PLR1的转录调控促进SDG的合成和积累。在高Ca2+胁迫后，PLR2（GH\UA08G1771）在R中特异性表达，在S中未检测到PLR2表达的变化，这表明只有PLR2对R中的高Ca2+胁迫有反应。因此，推测PLR2可能合成具有类似PLR1抗氧化特性的SDG。综上所述，PLR2可以调节ABA信号转导细胞功能相关的下游基因，共同提高高Ca2+胁迫下棉花清除活性氧的能力，从而增强棉花对高Ca2+胁迫的抗性。

5、高抗性棉花R缓解高Ca2+胁迫的分子机制

当Ca2+从细胞外或液泡涌入细胞质时，细胞质中的Ca2+浓度会增加，Ca2+会与一些Ca2+受体蛋白CaM和CML结合，形成Ca2+/CaM（CML）结合蛋白。激活的Ca2+信号导致一些下游转录因子的表达增加，如WRKY和bZIP，通过调节细胞内外水和离子的平衡，细胞在传递Ca2+信号后可以迅速恢复到低浓度Ca2+环境的状态。同时，一些激素也受Ca2+信号的调节，如ABA和SA，可以缓解棉花中的Ca2+瞬变。当植物暴露于高浓度的Ca2+时，它们再也不能抵抗单独由通道蛋白引起的大量Ca2+造成的损害。R将通过ROS清除机制与通道蛋白形成复杂的调节网络，共同缓解高Ca2+应激。渗透受体感应到Ca2+的增加，然后调节ABA的合成，激活ABA信号通路。首先，增加的ABA与PYL蛋白结合并与PP2C相互作用，通过SnRK促进一些下游因子的磷酸化，并启动ABA信号反应。此时，编码PLR2的转录因子ABRE和MYB被激活。然后，通过促进松脂醇合成落叶松烯醇，落叶松烯醇合成SDG，从而提高活性氧的清除能力，从而增强棉花抵御高Ca2+胁迫的能力（图4）。

结论

本文主要探讨不同棉花材料在高钙胁迫下的不同耐性机制。基于转录组数据和以往对非生物胁迫下各种机制的研究，推测棉花在高Ca2+胁迫下仍然通过Ca2+信号通路传递和激活各种信号。在高Ca2+胁迫后，与通道活性和抗氧化活性相关的基因可能占据相对较大的比例。通道蛋白通过平衡细胞内外的水和阴离子来缓解高钙胁迫下的渗透胁迫。同时，在Ca2+和ABA的相互作用下，棉花还通过促进SDG的生成来减轻氧化应激，从而减少ROS在棉花中的积累。棉花耐高浓度Ca2+的分子机制将有助于促进高Ca2+地区植物的生长发育，为西部喀斯特地貌区植被恢复和荒漠化防治提供重要帮助。