细菌16S rRNA基因全长约1,550个碱基对,由8个高度保守区和9个高变区(这些区域命名为V1至V9;图1)组成。在进行16S rRNA基因测序研究时,二代测序由于读长限制,往往使用通用引物扩增一个或几个高变区,而PacBio全长16S测序能够一次获得V1-V9区9个高变区序列,从而个获得更多信息,在种水平注释具有重要优势。尤其中在医学领域,全长16S rRNA基因测序已得到广泛运用,其中包括人肠道菌群研究、皮肤、鼻腔、母乳、癌组织、宫腔、口腔等。

图1.16S rRNA基因保守区和可变区的示例图。

今天给大家分享3篇全长微生物多样性的研究案例,快来看看吧!

案例一

标题:High-Level Acquisition of Maternal Oral Bacteria in Formula-Fed Infant Oral Microbiota

译名:配方奶喂养的婴儿口腔微生物群中母体口腔细菌的高水平获取[1]

期刊:mBio [IF:7.867]

发表时间:2022年1月

研究方法:全长16S rDNA测序

文章简介

背景:母体口腔微生物的大量涌入被认为在婴儿口腔微生物群的获得和发育中起着重要作用。

方法:研究者收集了448对母婴在4个月体检时的舌拭子样本,运用PacBio的16S rRNA全长基因单分子测序和扩增序列变异(ASV)方法研究每个样本的细菌组成。

结果:尽管婴儿口腔微生物区系与母亲口腔微生物群明显不同,但与其亲生母亲共享的ASV的相对丰度中位数显著高于与非亲缘母亲共享的ASV。这种共享丰度与婴儿的喂养方式密切相关,而不是他们的分娩方式或抗生素暴露,配方奶喂养的婴儿比纯母乳喂养的婴儿共享丰度更高。该研究提供了口腔细菌母婴传播的菌株水平证据,并表明在配方奶喂养的婴儿中,母亲口腔细菌的定殖率更高。

结论:通过全长16S rRNA基因测序和ASV序列分析的方法观察到母体口腔微生物群向婴儿的传播,配方奶喂养的婴儿获得母体口腔细菌的数量明显较高。此外,区分婴儿细菌的来源使婴儿口腔微生物群的细菌组成评估具有更高的分辨率。这种新的信息和方法可以为进一步研究口腔微生物群的发展奠定基础,并最终可为建立新的预防和治疗策略提供数据,运用于控制口腔微生物群的细菌平衡和致病性。

图2母婴对中口腔微生物群的微生物联系

(A) 基于BrayCurtis距离的母亲和婴儿样本的PCoA图。(B)优势OTU的平均相对丰度和共享指数。(C)母婴配对(n=448)和无关母婴配对(n=198,464)的Bray-Curtis距离的小提琴曲线图。(D)每名婴儿与亲生母亲(n=448)和与无亲缘关系的母亲(n=198,464)分享的ASV总相对丰度的小提琴曲线图。(E,F)与Veillonella dispar和 Streptococcus salivarius相对应的ASV的分布。

案例二

标题:Jia Wei Xiao Yao San ameliorates chronic stress-induced depression-like behaviors in mice by regulating the gut microbiome and brain metabolome in relation to purine metabolism

译名:加味逍遥散通过调节与嘌呤代谢有关的肠道微生物组和脑代谢组改善慢性应激诱导的抑郁样行为[2]

期刊:Phytomedicine  [IF: 5.340]

发表时间:2022年1月

研究方法:全长16S rDNA测序、非靶向代谢组学、行为测试、免疫荧光染色、细胞因子的定量等

文章简介

背景:抑郁症的发病机制很大程度上仍不清楚。越来越多的证据表明,肠道微生物群组成和脑功能之间存在着复杂的关系。加味逍遥散(JWXYS)被认为是一种潜在的抗抑郁药物,但其药理作用机制尚未阐明。该文章探讨了加味逍遥散散对慢性应激诱导的小鼠抑郁行为的影响。

方法:建立慢性束缚应激抑郁小鼠模型。给予加味消炎散,通过多项行为学测试评价小鼠对治疗的反应。用特异性荧光标记法检测星形胶质细胞和小胶质细胞的活性;对肠道和脑组织中的炎性细胞因子进行定量。采用全长16S rRNA测序和非靶向代谢组学相结合的方法,从物种水平上研究肠道微生物群、代谢脑功能和JWXYS之间的关系。

结果:发现行为症状与动物乳杆菌( L. animalis)的相对丰度有关。经JWXYS处理后,描述了具有潜在参与嘌呤代谢的酶的Ileibacterium valens菌的相对丰度。星形胶质细胞和小胶质细胞的激活与动物乳杆菌的相对丰度呈负相关。结合网络药理学分析,在加味消炎散治疗的基础上预测的几个靶点集中在嘌呤代谢上,嘌呤代谢也富含JWXYS调节的脑代谢物。

结论:动物乳杆菌参与了小鼠的抑郁样行为,加味消炎散可增加大脑嘌呤代谢相关酶的活性,并与杏仁核星形胶质细胞的激活呈正相关。

图3.(A)不同群体的阿尔法多样性指数(Chao1、PD_Whole_Tree.、Shannon、Simpson)的变化。(B)不同组样本的beta多样性指数(Bray-Curtis,未加权UniFrac)的特征。(C)基于对照组、模型组和JWXYM组之间的Lefse分析,确定肠道微生物组的潜在生物标志物。

案例三

标题:Evaluations and comparisons of microbial diversities in four types of body fluids based on two 16S rRNA gene sequencing methods

译名:基于两种16S rRNA基因测序方法对四种体液微生物多样性的评价与比较[3]

期刊:Forensic Science International  [IF: 2.395]

发表时间:2021年11月

研究方法:全长16S rDNA测序、二代16S rDNA测序

文章简介

背景:体液是犯罪现场常见的生物痕迹之一。了解这些生物痕迹的类型可以为法医案件的调查提供关键线索。近年来,16S rRNA基因部分高变区测序和全长16S rRNA基因测序引起了研究人员的兴趣,

方法:采用二代16S rRNA基因V3-V4短读长测序和基于单分子实时测序的16S rRNA基因全长测序,对唾液、外周血、阴道分泌物和月经血中的微生物进行分类。

结果:短读长测序的α多样性指数大于全长测序。两个平台采集的4种体液中细菌类群水平相似,但丰度不同。主坐标分析和分子方差分析结果表明,阴道分泌物和经血的微生物组成相似,唾液、外周血、阴道分泌物和经血的微生物组成有显著差异。线性判别分析表明,四种体液中筛选出的差异细菌在两种测序结果中存在差异。两种测序方法均可用于检测4种不同体液中的细菌多样性,为微生物鉴定4种体液提供了潜在的工具,其中全长测序能提供更准确的分类。

图4.属水平上四种体液细菌丰度柱状图。

全长微生物多样性研究现状

根据PubMed检索结果,我们可以看到运用全长微生物多样性发表的文章逐年递增。一方面随着测序技术也越来越成熟;另一方面PacBio sequel II通量的提升使得研究成本大幅降低,全球越来越多的研究学者开始采用全长微生物多样性测序来进行微生物组学研究。

全长微生物多样性优势一:数据准确性高

PB全长多样性测序基于HIFI模式对单一片段进行多轮测序的方式来提升准确性。由于PacBio的原始错误为随机错误,可通过获取CCS(Circular Consensus Sequencing)进行自身纠正来提升数据的准确性。

 

细菌16S全长约1.5Kb,目前PacBio Sequel II测序平台平均酶读长可以达到70 Kb,当测序酶读长达到 8Kb时,就可以满足一条1.5Kb的16S全长纠错5次,同一片段测序 5 次后,单一Read的准确性至少达到Q20(99%)

全长微生物多样性优势二:种水平注释率高

运用三代测序,可以轻松跨越V1-V9区,进而获得全长序列,序列中携带的特征信息更多,可以支持“种”水平的分辨率,在文章撰写中可在种水平进行深入挖掘和讨论,尤其是在biomarker的寻找。常规样本平均种水平注释率可达60%。

百迈客微生物数据实测

全长微生物多样性优势三:群落结构更准

不同物种不同高变区的变异程度不同,部分高变区研究可能严重低估或者高估群落中微生物的多样性,不同高变区短读长扩增子的PCR引物选择会影响推断的群落准确性和某些细菌类群的敏感性,使得微生物组研究很难在全局水平上进行比较;全长微生物多样性一次获得全部保守区和高变区序列,能够精准还原微生物群落结构。

横轴表示物种,纵轴表示丰度,黑色柱子表示全长16S鉴定准确而V4区测序失真;白色柱子表示V4区鉴定准确而全长16S结果失真,对比可以看出,全长16S的覆盖度和准确度更高。E Singer et al. ISME J

不同物种不同高变区的变异程度,物种多样性被低估或者高估

 

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参考文献:

[1]Kageyama S, Furuta M, Takeshita T, et al. High-Level Acquisition of Maternal Oral Bacteria in Formula-Fed Infant Oral Microbiota[J]. Mbio, 2022, 13(1): e03452-21.

[2]Ji S, Han S, Yu L, et al. Jia Wei Xiao Yao San Ameliorates Chronic Stress-Induced Depression-Like Behaviors in Mice by Regulating the Gut Microbiome and Brain Metabolome in Relation to Purine Metabolism[J]. Phytomedicine, 2022: 153940.

[3]Mei S, Zhao M, Liu Y, et al. Evaluations and comparisons of microbial diversities in four types of body fluids based on two 16S rRNA gene sequencing methods[J]. Forensic Science International, 2022, 331: 111128.

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