百迈客生物与广东省科学院动物研究所合作，两年(2020-2021)连发3篇文章，影响因子总计13.934，文章结合药敏试验、细菌完成图测序、MLST分型和比较基因组学等分析，深度解析了多重耐药菌克雷伯氏菌和奇异变形杆菌的耐药机制和可能的传播途径，对于未来探索细菌抗性基因的传播扩散机制具有重要意义。
在恭喜老师论文发表的同时，我们对文章进行了解读，分享给各位读者，本期分享的为细菌基因组成功案例，希望能够为各位老师提供研究思路。
成功案例一：中国红袋鼠超广谱β-内酰胺酶多重耐药肺炎克雷伯菌的特征及流行病学研究
期刊：Frontiers in Microbiology
影响因子：5.640
发表时间：2020年10月
合作单位：广东省科学院动物研究所
研究方法：全基因组测序(ONT)，药敏试验，质粒接合与转化实验，MLST分型
研究内容
β-内酰胺酶的耐药性对公共卫生构成了严重的挑战。产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌克隆的报道越来越多。人们对动物园中耐药菌株的流行率和生物学特征知之甚少。在郑州动物园的常规监测中，研究者在健康红袋鼠(Macropus Rufus)体内发现了严重多重耐药肺炎克雷伯菌。研究者从红袋鼠中分离出1株多重耐药肺炎克雷伯菌，通过全基因组测序表明菌株染色体基因组Chr-M297-1携带blaDHA-3、blaSHV-1、blaCTX-M-14等抗性基因；pM297-1.1携带blaCTX-M-14、blaTEM-191等9个抗性基因；pM297-1.2携带blaTEM–1、blaCTX–M–3等22个抗性基因。可追溯性分析表明，这两个质粒与从中国四川省南部一些城市的人类临床样本中提取的质粒高度相似(>99%)，表明这些质粒在中国正在传播。此外，通过E. coli J53接合试验表明两个携带接合转移基因的质粒通过接合促进了抗菌基因的传递。该研究表明，产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的传播和适应发生在动物园环境中，动物园可能成为临床重要耐药基因的重要潜在储存库。因此，有必要监测动物园环境下圈养野生动物中耐药基因株的出现和传播情况。
图1.多重耐药肺炎克雷伯氏菌M297-1分离株质粒中的抗生素抗性基因、插入序列和复合转座子结构特点。
(A)pM297-1.1与其同源质粒MDR区域特性及比较；(B)pM297-1.2与其同源质粒MDR区域特性及比较。
成功案例二：克雷伯氏菌多复制子抗性质粒介导广泛抗性基因传播
期刊：Frontiers in Microbiology
影响因子：5.640
发表时间：2021年10月
合作单位：广东省科学院动物研究所
研究方法：全基因组测序(ONT)，多重耐药表型评估，比较基因组分析
研究内容
多复制子耐药质粒已成为革兰氏阴性菌耐药基因的重要载体，但多复制子质粒的进化尚不清楚。该研究采用微量肉汤稀释法对2018年至2020年从不同野生动物和环境中分离到的56株克雷伯氏菌进行了表型鉴定，并对其进行了测序和分析，以进行细菌全基因组关联研究。结果表明，非人类来源的菌株对氨苄西林的耐药率较高(80.36%)，且耐药范围较广。马来亚穿山甲分离株对头孢类抗生素高度耐受，同时对氯霉素、左氧氟沙星和复方新诺明等药物耐受。基因组分析表明，这些菌株的抗性质粒携带多种抗生素耐药基因。进一步对69个质粒序列分析表明，28个质粒为多复制子质粒，主要携带blaCTX-M-15、blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、blaOXA-1和blaTEM-1等β-内酰胺酶基因。对不同分离株携带的质粒分析表明，Klebsiella pneumoniae可能是一种重要的多复制子质粒宿主。质粒骨架和结构分析表明，多拷贝质粒是由两个或两个以上的单个质粒融合而成，对抗生素环境具有很强的适应性，不断增强耐药菌株在世界范围内传播的能力。综上所述，多复制子质粒比非复制子质粒能够更好地携带抗性基因，这可能是细菌对高抗生素压力环境反应的重要机制。该研究对于未来探索细菌抗性基因的传播扩散机制具有重要意义。
图2.基于16S rRNA序列的系统发育树的构建。
内环1：分离物种；内环2：菌种；内环3：携带质粒的菌株；外环：携带β-内酰胺类耐药基因和氨基糖苷类耐药基因的质粒。
成功案例三：从中国野生动物分离的多重耐药奇异变形杆菌：增加公共卫生风险
期刊：Integrative Zoology
影响因子：2.654
发表时间：2021年7月
合作单位：广东省科学院动物研究所
研究方法：全基因组测序(ONT)，耐药基因分析
研究内容
奇异变形杆菌(Proteus Mirabilis)临床分离株出现多重耐药(MDR)是一个日益严重的公共卫生问题，并对野生动物造成严重影响。作者从12个不同物种中分离鉴定了54株奇异变形杆菌（P. mirabili）。药敏结果表明25株为多重耐药菌株。采用全基因组测序方法对10株分离株进行比较基因组分析。结果表明，奇异变形杆菌主要携带碳青霉烯类耐药基因blaOXA-1、blaNDM-1和blaTEM-1。TN21、TN7和SXT/R391移动元件导致这些耐药基因的广泛传播。综上所述，从野生动物分离的P.mirabilis对临床常用药物的耐药性高于从人类分离的。因此，携带MDR临床分离株的野生动物应引起公共卫生部门的重视。
图3.抗生素抗性基因的传播循环架构:涉及人类、动物和环境的多个方面。
总结
通过以上三篇文章，我们可以发现，菌株耐药性研究，一般流程为：1）菌株分离；2）药敏试验；3）细菌基因组测序；4）耐药基因分析；5）比较基因组分析；通过三代测序（Nanopore/PacBio）可获得细菌基因组的完整序列，进而可在基因组层面深入研究菌株耐药基因与传播机制。
以上论文的测序和部分数据分析工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。如您有任何疑问，欢迎讨论区留言或者发邮件给我们（邮箱地址：tech@biomarker.com.cn）
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参考文献：
1. Wang X, Zhao J, Ji F, et al. Multiple-Replicon Resistance Plasmids of Klebsiella Mediate Extensive Dissemination of Antimicrobial Genes[J]. Frontiers in microbiology, 2021: 3159.
2. Wang X, Zhao J, Ji F, et al. Multiple-Replicon Resistance Plasmids of Klebsiella Mediate Extensive Dissemination of Antimicrobial Genes[J]. Frontiers in microbiology, 2021: 3159.
3. Kang Q, Wang X, Zhao J, et al. Multidrug‐resistant Proteus mirabilis isolates carrying blaOXA‐1 and blaNDM‐1 from wildlife in China: increasing public health risk[J]. Integrative Zoology, 2021, 16(6): 798-809.
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